Resumo: A enzima Ciclomaltodextrina Glucano-Transferase (CGTase) é industrialmente importante pelo fato de ser única na produção de ciclodextrinas (CDs). As CDs pertencem à família dos oligossacarídeos macrocíclicos que são capazes de formar complexos do tipo receptor-substrato, com habilidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de substâncias que têm suas propriedades alteradas pela complexação, sendo este o principal motivo pelo qual as CDs vêm sendo bastante utilizadas em produtos industriais, tecnológicos e em métodos analíticos, fármacos, alimentos ou em cosméticos. O objetivo desta dissertação foi estudar a cinética envolvida na obtenção da enzima CGTase em processo descontínuo alimentado através da síntese de ciclodextrinas, utilizando amido com substrato e o micro-organismo Bacillus firmus Cepa 37, e avaliar as respostas de crescimento celular, atividade enzimática e demais variáveis envolvidas no processo de fermentação. As fermentações foram realizadas em biorreator Bioflo III operado de forma descontínua e descontínua alimentada, para obtenção de parâmetros (pH, temperatura, dosagem de substratos, consumo de substrato, produção de proteínas solúveis, entre outros, em função do tempo de cultivo) com a finalidade de melhorar a atividade da enzima CGTase com rendimento bacteriano. Foram realizados também, experimentos de forma descontínua em incubadora com agitação (shaker) para posterior comparação dos resultados. O meio de cultivo para o desenvolvimento bacteriano foi baseado em estudos anteriores de diferentes autores, utilizando o meio padrão de Horikoshi e suas modificações. Neste estudo, foram realizados um total de nove conjuntos de ensaios em diferentes condições, variando o tipo de substrato, a concentração de extrato de levedura e tempo de cultivo. Para a síntese das CDs pela CGTase, utilizando o amido solúvel e o amido comercial, observou-se que este último apresentou valores ligeiramente superiores principalmente em relação a produção de γ-CD. Os melhores resultados obtidos para produção da enzima CGTase na síntese da γ-CD foram verificados nos ensaios onde foram aplicados pulsos de amido e onde foram feitas realimentações do meio de cultivo, dentre eles, o ensaio 7, com aproximadamente 0,26 U/mL para γ-CD e uma menor produção foi obtida para β-CD, de aproximadamente 0,04 U/mL. Para a produção de CGTase na síntese da β-CD, o melhor resultado foi verificado no ensaio onde não houve realimentação e nem aplicação de pulsos de amido (Ensaio 3) em torno de 0,12 U/mL, porém a produção de CGTase para a síntese de γ-CD foi a menos efetiva de todos os ensaios realizados, em torno de 0,02 U/mL. Deste modo, observou-se que a forma descontínua ou descontínua alimentada na operação do biorretor influencia na produção das diversas enzimas CGTase, assim como, a composição do meio de cultivo utilizado também mostrou influência, particularmente na variação da concentração de extrato de levedura. Em estudos anteriores, foi verificado que o Bacillus firmus Cepa 37 tem a capacidade de produzir preferencialmente β-CD, porém, neste estudo observou-se um efeito positivo na produção de γ-CD nos ensaios com realimentação do meio de cultivo e também nos ensaios com aplicação de pulsos de amido, este efeito vantajoso pode ser considerado, uma vez que a γ-CD apresenta maior valor comercial devido sua capacidade de inclusão de moléculas maiores.
Abstract: The Cyclomaltodextrin Glucanotransferase enzyme (CGTase) is industrially important due to the fact of being the only enzyme in production of cyclodextrins (CDs). The CDs belongs to the family macrocyclic oligosaccharides that are capable to form complexes of receptor-substrate type, with the ability to form inclusion complex with a variety of substances which have their properties changed by complexation, this is the main reason why CDs are been widely used in industrial, technological products and in analytical methods, pharmaceutical drugs, foods or cosmetics. The aim of this dissertation was to study the kinetics involved in obtaining the CGTase enzyme in a fed batch process by the synthesis of cyclodextrins, using starch as substrate and the Bacillus firmus Strain 37 micro-organism, and evaluate the cell growth responses, enzymatic activity and other variables involved in the fermentation process. The fermentation tests were performed in Bioflo III reactor operating in batch and fed-batch, for obtaining the parameters such as pH, temperature, dosages substrates, substrate consumption, production of soluble proteins, and among others, in order to improve the activity of the CGTase enzyme with the bacterial yield. Were also performed discontinuous tests in shaking incubator (shaker) for further comparison of results. The culture medium for bacterial growth was based on previous studies of different authors using the standard medium of Horikoshi and its modifications. In this study, we performed a total of nine sets of tests in different conditions by varying the substrate type, the concentration of yeast extract and cultivation time. For the synthesis of CDs by the CGTase enzyme using soluble starch and the commercial starch, it was observed that the commercial starch showed slightly higher values mainly in relation to the production of γ-CD. The better results obtained for the production of CGTase enzyme in γ-CD synthesis were observed in tests where starch pulses were applied and feedback of the medium, among the tests, the test 7, with approximately 0.26 U/mL for γ-CD and a lower yield was obtained for β-CD, about 0.04 U/ml. For production of CGTase in β-CD synthesis, the better result was observed in the test where there was no feedback and no starch pulses applied (Test 3) about 0.12 U / mL, however the production of CGTase for γ-CD synthesis was the less effective of all test performed, about 0.02 U/ ml. Thus, was observed that the batch or fed-batch in the biorretor operation influences the production of several CGTase enzymes, as well as the composition of the medium used also showed influence, particularly on the variation of yeast extract concentration. In previous studies, it was verified that Bacillus firmus Strain 37 is capable to produce preferably β-CD, however, in this study observed a positive effect on the production of γ-CD in the tests with feedback of the culture medium and also in tests with application of starch pulses, this advantageous effect may be considered, since the γ-CD exhibit a higher commercial value due to the ability to include larger molecules. |