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Consultar: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Título [PT]: Pseudomonas aeruginosa : genotipagem, alterações estruturais e expressão gênica diferencial após exposição à combinação de meropenem e ciprofloxacino
Título [EN]: Pseudomonas aeruginosa: Genotyping, Structural changes and differential gene expression after exposure to the meropenem and ciprofloxacin combination
Autor(es): Vera Lúcia Dias Siqueira
Palavras-chave [PT]:

Pseudomonas aeruginosa. Multirresistência antimicrobiana. Combinação antimicrobiana. Meropenem,.Ciprofloxacino. Expressão gênica. Brasil.

Pseudomonas aeruginosa. Multidrug resistance. Antimicrobial combination. Meropenem. Ciprofloxacin. Gene expression. Brazil.

Celso Vataru Nakamura (Orientador) - UEM Gerson Nakazato Herida Regina Nunes Salgado Maria Cristina Bronharo Tognim Sueli Fumie Yamada Ogatta

Resumo: O uso de combinações antimicrobianas para o tratamento de infecções por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes é comum na prática clínica. Entretanto, o mecanismo de ação destas associações mantém-se em grande parte desconhecido. O presente estudo identificou alterações estruturais e genes diferencialmente expressos decorrentes da exposição a concentrações subinibitórias de meropenem e ciprofloxacino isoladamente e em combinação (MCC) em um isolado clínico genotipicamente distinto de P. aeruginosa multirresistente (1071-MRPA). Os resultados deste trabalho foram compilados em dois manuscritos apresentados no capítulo II. Inicialmente, P. aeruginosa isoladas de pacientes internados em um hospital universitário de Maringá, Paraná, Brasil, entre janeiro de 2007 e julho de 2009, foram genotipadas pela técnica enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR). Trinta e dois isolados genotipicamente distintos, multirresistentes e com resistência a pelo menos um dos antimicrobianos estudados, foram selecionados para determinação in vitro da ação antimicrobiana de MCC. Esta combinação foi sinérgica para 25,0% e 40,6% dos isolados de P. aeruginosa testados por checkerboard e curva de tempo de morte, respectivamente. Posteriormente, foram avaliadas alterações estruturais por microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e alterações na expressão gênica, por análise da representação diferencial (Representational Difference Analysis, RDA) e PCR quantitativa em tempo real (qPCR), decorrentes da ação sinérgica de MCC em 1071-MRPA. Pela microscopia eletrônica, uma somatória das alterações morfológicas e estruturais observadas em 1071-MRPA expostas aos antimicrobianos isoladamente, foi visualizada nas células bacterianas expostas à MCC. Entretanto, vesículas de membrana externa, normalmente relacionadas à resposta SOS bacteriana e efeitos citotóxicos no hospedeiro, foram observadas em maior número após exposição ao ciprofloxacino e significantemente inibidas em MCC. Genes relacionados à biossíntese da parede celular e reparo de DNA, entre outros, foram diferencialmente expressos em 1071-MRPA exposta a meropenem, ciprofloxacino e MCC. Adicionalmente, as análises por qPCR revelaram que além dos genes diferencialmente expressos relacionados ao reparo de danos em parede celular e DNA, genes relacionados à resistência aos antimicrobianos estudados e regulação da resposta SOS bacteriana foram menos expressos durante a exposição à MCC. Os resultados deste estudo sugerem que MCC pode ser uma alternativa para o tratamento de infecções por P. aeruginosa multirresistentes. Além disso, os efeitos de MCC em 1071-MRPA podem não somente resultar da somatória dos efeitos dos antimicrobianos isoladamente, mas uma ação diferenciada, provavelmente no mecanismo de proteção bacteriana. Abstract: The use of antimicrobial combinations for the treatment of Pseudomonas aeruginosa infection is common in clinical practice. However, the mechanism of action of these combinations remains largely unknown. The present study identified structural changes and differentially expressed genes in a genotypically distinct multi-drug resistant P. aeruginosa clinical isolate (1071-MRPA) caused by exposure to subinibitory concentrations of meropenem and ciprofloxacin alone and in combination (MCC). The results of this study were compiled into two manuscripts presented in Chapter II. Initially, P. aeruginosa isolates were obtained from patients in a university hospital in Maringá, Paraná, Brazil, from January 2007 to July 2009. The isolates were genotyped by enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR). Thirty-two genetically distinct multidrug-resistant P. aeruginosa isolates and P. aeruginosa isolates resistant to at least one of two antimicrobials, were selected for the in vitro determination of the antimicrobial action of the MCC. This combination was synergistic to 25.0% and 40.6% of the P. aeruginosa isolates tested by checkerboard and time-kill curve assays, respectively. Subsequently, because of the synergistic action of the MCC in 1071-MRPA, structural changes were assessed by scanning and transmission electron microscopy and gene expression using Representational Difference Analysis (RDA) and quantitative real-time PCR (qPCR). Electron microscopy indicated that the MCC caused a summation of the structural and morphological changes induced by the antimicrobials alone in 1071-MRPA. However, outer membrane vesicles that are normally related to the bacterial SOS response and cytotoxic effects in the host were greater amount with ciprofloxacin exposure and significantly inhibited in MCC-exposed cells. Genes related to cell-wall and DNA repair, among others, were differentially expressed in meropenem-, ciprofloxacin-, and MCC-exposed 1071-MRPA. Additionally, qPCR analysis revealed that besides of differentially expressed genes, associated with DNA and cell wall repair, genes related to bacterial SOS response regulation and antimicrobial resistance exhibited lower expression in MCC-exposed cells. The present study suggests that the MCC may be an alternative for the treatment of infections caused by P. aeruginosa. The effect of this antimicrobial combination may be not only the result of a summation of the effects of meropenem and ciprofloxacin but also a result of differential action that likely affects protective mechanisms in the bacteria.

Idioma: mul Data de Publicação: 2013 Local de Publicação: Maringá, PR Orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura Instituição: Universidade Estadual de Maringá . Centro de Ciências da Saúde Nível: Tese (doutorado em Ciências Biológicas) UEM: Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

Responsavel: edson
Categoria: Aplicação
Formato: Documento PDF
Arquivo: Tese Vera Lúcia Dias Siqueira 2013.pdf
Tamanho: 1956 Kb (2003364 bytes)
Criado: 17-01-2018 16:14
Atualizado: 17-01-2018 16:19
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