Resumo: Huanglongbing se destaca como a doença mais importante da citriculura no mundo. A ausência de materiais genéticos resistentes torna seu manejo difícil e oneroso. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade entre isolados estritamente relacionados, monitorar a população de 'Candidatus Liberibacter asiaticus' em plantas de citros na Região Noroeste do Paraná, bem como validar um método de extração direto de DNA para detecção em PCR em tempo real. O estudo da variabilidade foi conduzido em plantas cítricas em pomar experimental (Maringá-PR), através do uso microssatélites associados com regiões contendo seqüências simples repetidas (SSR) da bactéria. A variação estacional da população bacteriana foi estudada em mudas de citros mantidas em casa de vegetação, em plantas de laranja doce em pomar experimental e plantas de lima ácida Tahiti em pomar comercial no município de Maringá-PR e em plantas de laranja doce em pomar comercial no município de Paranavaí-PR. A população bacteriana foi monitorada por PCR em tempo real através da coleta mensal de folhas sintomáticas a partir da detecção da bactéria na planta. Os métodos de preparação direto de amostra foram realizados com protocolo de detecção de PCR em tempo real com a utilização de sonda TaqMan®. A estrutura genética da população foi determinada incluindo 21 haplótipos agrupados em três grupos principais. O estudo revelou que a diversidade genética está presente na área desde o ínicio da manifestação do HLB. Foram observadas diferenças significativas nos valores de Ct (Cycle Threshold) em amostras coletadas nas diferentes estações do ano e o outono foi a melhor época para a detecção da bactéria em plantas no campo. O método de extração direto foi validado e eficiente na detecção de 'Ca. Liberibacter asiaticus', demonstrando boa concordância com amostras cuja purificação de DNA foi realizada.
Abstract: Huanglongbing stands out as the most important disease of citrus worldwide. The absence of genetic materials resistant makes its management difficult and costly. Thus, the aim of this study was to evaluate the variability among isolates closely related, monitor the population of 'Ca. Liberibacter asiaticus' in citrus plants in northwestern Paraná, and validate a method for direct extraction of DNA for real time PCR detection. The variability study was conducted in citrus plants in an experimental orchard (Maringá-PR) through the use of microsatellite regions associated with Simple Sequence Repeats (SSR) of the bacterium. Seasonal variation of the bacterial population was studied in citrus seedlings maintained in a greenhouse, in sweet orange plants in an experimental orchard, and Tahiti acid lime plants in a commercial orchard in Maringá, Paraná State, and still, sweet orange plants in a commercial orchard in Paranavaí, Paraná. The bacterial population was monitored by real-time PCR by collecting monthly symptomatic leaves from the detection of the bacterium in the plant. The methods of sample preparation were directly performed with detection protocol real-time PCR using TaqMan® probe. The population genetic structure was determined by including 21 haplotypes, grouped into three main groups. The research revealed that genetic diversity is present in the area since the beginning of the manifestation of HLB. There were significant differences in Ct (Cycle Threshold) in samples collected in different seasons, and autumn was the best time for detection of bacteria in plants in the field. The direct extraction method was validated and efficient to detect 'Ca. Liberibacter asiaticus', showing similar agreement with samples whose DNA purification was performed. |
