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Ttulo [PT]: Atividades leishmanicida e imunomoduladora do leo essencial e do isolado 6,7-dehidroroileanona derivados de Tetradenia riparia (Hochstetter) Codd
Ttulo [EN]: Antileishmanial and immunomodulatory activitiy of the essential oil and 6,7- dehydroroyleanone from Tetradenia riparia (Hochstetter) Codd
Autor(es): Izabel Galhardo Demarchi
Palavras-chave [PT]:

Leishmania. Leishmaniose cutnea. Tetradenia riparia. Citocinas. Diterpeno. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Leishmania. Cutaneous leishmaniasis. Tetradenia riparia. Cytokines. Diterpene. Brazil.
rea de concentrao: Doenas Infecciosas e Parasitrias
Titulao: Doutor em Cincias da Sade
Banca:
Maria Valdrinez Campana Lonardoni [Orientador] - UEM
Juliana Curi Martinichen Herrero - UEM
Ciomar Aparecia Bersani Amado - UEM
Ricardo Alberto Moliterno - UEM
Arildo Jos Braz de Oliveira - UEM
Wander Rogrio Pavanelli - UEL
Resumo:
Resumo: A leishmaniose cutnea causada por protozorios do gnero Leishmania e caracterizada por leses na pele localizadas ou disseminadas. A espcie Leishmania (Leishmania) amazonensis responsvel pela forma clnica cutnea e cutnea difusa, a mais grave forma clnica e de difcil tratamento. Esta espcie geralmente mostra resistncia teraputica levando falha da terapia e agravamento da doena. O tratamento atual para a leishmaniose pode provocar graves efeitos adversos e toxicidade. Neste contexto, os produtos naturais so considerados potenciais candidatos para a terapia alternativa da leishmaniose, pois alm da atividade leishmanicida, possuem a capacidade de modular citocinas da resposta imune do hospedeiro, a qual essencial para a resoluo da doena. A planta Tetradenia riparia utilizada como tradicionalmente na frica para o tratamento de doenas inflamatrias e infecciosas. Os extratos e o leo essencial derivados desta planta apresentam propriedades antioxidantes, anticarcinognica e antimicrobiana. Embora esta planta seja utilizada como remdio popular por diferentes populaes para a cura de uma diversidade de doenas, poucos estudos tm investigado os efeitos anti-Leishmania e imunomoduladores da planta T. riparia. O leo essencial derivado de T. riparia (TrEO) um rico complexo de terpenoides, incluindo os diterpenos (hidrocarbonetos ou oxigenados) relacionados com a atividade antimicrobiana dos leos essenciais. O diterpeno 6,7-dehidroroileanona derivado de T. riparia (TrROY) foi recentemente descrito na literatura, e ainda h poucos estudos sobre as propriedades farmacolgicas deste composto. Assim, neste estudo foi investigado: o potencial leishmanicida do TrEO e do TrROY sobre formas promastigotas e amastigotas de L. (L.) amazonensis; a citoxicidade de TrEO e TrROY sobre macrfagos murinos e eritrcitos humanos; a produo de nitrito e a expresso de xido ntrico sintase induzvel (iNOS) por macrfagos murinos infectados com L.(L.) amazonensis e tratados com TrEO; a imunomodulao de macrfagos murinos tratados com TrEO; e a modulao da expresso gnica e da produo de citocinas por macrfagos murinos tratados com TrEO e infectados com L. (L.) amazonensis. Os efeitos de TrEO e TrROY sobre formas promastigotas de Leishmania foram avaliados utilizando as metodologias de contagem microscpica convencional, de reduo do XTT (2,3-bis-[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5- [(fenilamino), e ainda foi realizada a microscopia eletrnica de transmisso para verificar as alteraes ultraestruturais das formas promastigotas tratadas com TrEO. Os efeitos citotxicos de TrEO e TrROY para macrfagos murinos foram avaliados utilizando o mtodo de XTT e de excluso de Trypan Blue, e para eritrcitos humanos foi realizado o teste de hemlise a partir da leitura em espectrofotmetro. Para verificar os efeitos de TrEO e TrROY sobre as formas intracelulares de Leishmania, macrfagos peritoneais obtidos de camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e posteriormente tratados com TrEO e TrROY, por microscopia convencional obteve-se a porcentagem de clulas infectadas e o nmero mdio de formas amastigotas por macrfago. A tcnica de reao em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) tambm foi realizada para verificar a quantidade de parasitos baseando-se na deteco do DNA de Leishmania. Para os estudos de imunomodulao, macrfagos peritoneais murinos foram infectados com Leishmania e tratados com 30 ng/mL de TrEO. Aps os perodos de incubao de 3, 6 e 24 h, a produo de nitrito foi determinada por espectrometria utilizando o mtodo de Griess, e a expresso da enzima xido ntrico sintetase induzvel (iNOS) e de citocinas (interleucinas, IL-1β, IL-2, IL4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, IL-33; interferon-γ, IFN-γ; fator de necrose tumoral, TNF; fator de crescimento de colnias de macrfagos e granulcitos, GM-CSF) foi verificada pelo mtodo de PCR semi-quantitativo associado transcriptase reversa. A produo de citocinas foi verificada por citometria de fluxo. Para a anlise estatstica considerou-se um intervalo de confiana de 95%. TrEO e TrROY promovem a morte de promastigotas de L. (L.) amazonensis em at 72 h de incubao. TrEO foi mais efetivo que TrROY, a dose letal em 50% (DL50) de TrEO foi de 0,8 μg/mL e de TrROY de 3 μg/mL. TrEO e TrROY no mostraram citotoxicidade sobre eritrcitos humanos, mas TrROY mostrou toxicidade para macrfagos murinos resultando em uma baixa seletividade das substncias para o parasito em relao s clulas. Na concentrao de 0,03 μg/mL, o TrEO foi capaz de modificar as ultraestruturas de promastigotas sugerindo o processo de morte celular por autofagia indicada pela presena de condensao da cromatina, formao de blebbing de membrana, perfis membranosos e fragmentao nuclear. Os macrfagos tratados com 0.03 μg/mL de TrEO e 10 μg/mL de TrROY mostraram uma reduo de 65 e 48% no ndice de infeco por Leishmania, respectivamente. TrEO e TrROY no induziram a expresso de iNOS e a produo de nitrito em macrfagos infectados com Leishmania. Embora, o TrEO no tenha modificado a via do xido ntrico, TrEO modulou a expresso gnica e a sntese de citocinas de macrfagos murinos no infectados e tratados em todos os perodos estudados. A modulao da expresso gnica ocorreu somente nos perodos de 3 e 6 h, enquanto que os efeitos sobre a produo das citocinas foram observados at 24 h. A expresso e produo de 1β, IL-12, IL-17 e IFN-γ foram altamente induzidas por TrEO em 3 h, e somente a IL-1β foi expressa e produzida em altos nveis em 6 h, os quais foram reduzidos gradualmente at o perodo de 24 h. A IL-2 foi produzida em altos nveis no incio da incubao, e GM-CSF e IL-17 mais tardiamente (24 h). TrEO inibiu significativamente a produo de IL-10 e IL-6 em macrfagos murinos. Em macrfagos infectados com Leishmania e tratados com TrEO, houve um significativo estmulo para produo de IFN-γ e inibio de IL-1β, IL-6, IL-17, IL- 33, TNF, e de citocinas da resposta do tipo TH2 (linfcitos T helper, IL-4, IL-5 e IL-10). Os nveis de IL-12 foram mantidos a nveis normais pelo tratamento com o TrEO. Enquanto que a infeco por L. (L.) amazonensis estimulou a produo de IL-10, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 e IL-33, e inibiu IL-12 e IFN-γ produzidos pelos macrfagos infectados e no tratados. TrEO e TrROY promovem a morte dos parasitos L. (L.) amazonensis possivelmente por alteraes no metabolismo mitocondrial, respiratrio e lipdico. O TrEO em baixas concentraes no apresenta citotoxicidade s clulas e capaz de modular a expresso gnica e a produo de citocinas importantes da resposta imunolgica. O perfil de citocinas induzido pelo tratamento com o TrEO na ausncia da infeco est associado ao estmulo da resposta imune inata celular e a supresso de citocinas de clulas TH2. Assim, TrEO poderia ser uma alternativa teraputica para vrias doenas em que a resposta imune celular crucial para a sua resoluo, como nas doenas infecciosas, autoimunes e no cncer. Os efeitos do TrEO sobre a leishmaniose, sugere que o TrEO capaz de regularnegativamente as citocinas TH2 envolvidas com a progresso da leishmaniose, e aumenta IFN-γ que essencial para a resoluo da doena. Todos esses resultados sustentam o uso da planta T. riparia como medicamento popular para o tratamento de infeces parasitrias como a leishmaniose, e outras doenas que requerem a modulao da resposta imune. O TrEO poderia ser utilizado como terapia alternativa para o tratamento da leishmaniose ou concomitante aos medicamentos preconizados, por isso, sugere-se que ensaios in vivo e em humanos sejam conduzidos para garantir a sua eficcia e o uso seguro deste tratamento.

Abstract: Cutaneous leishmaniasis is caused by protozoa of the genus Leishmania, and it is characterized by skin lesions localized or disseminated. Leishmania (Leishmania) amazonensis is responsible agent for cutaneous and diffuse cutaneous, the most severe clinical and difficult to treat form. This species usually shows therapeutic resistance leading to therapy failure and worsening injury. The current treatment for leishmaniasis has caused serious side effects and toxicity. In this context, the natural products are considered potential candidates for alternative therapy for leishmaniasis, as well the leishmanicidal activity, products able to modulate cytokines of the host immune response are essential for the resolution of the disease. The Tetradenia riparia plant is used as traditionally in Africa for the treatment of inflammatory and infectious diseases. The extracts and the essential oil derived from this plant have antioxidant, anticarcinogenic and antimicrobial properties. Although this plant is used as a folk medice in different populations for curing a variety of diseases, few studies have investigated the anti-Leishmania and immunomodulatory effects of the T. riparia plant. The essential oil derived from T. riparia (TREO) is a rich complex of terpenoids, including diterpenes (or oxygenated hydrocarbons) related to the antimicrobial activity of essential oils. The diterpene 6,7-dehidroroileanona derived from T. riparia (TrROY) has recently been described in the literature, there are few studies on the pharmacological properties of this compound. In this study, we investigated: the leishmanicidal potential TrEO and TrROY on promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis; the cytotoxicity of TrEO and TrROY on murine macrophages and human erythrocytes; the production of nitrite and nitric oxide synthase mRNA expression (iNOS) by murine macrophages infected with L. (L.) amazonensis and treated with TrEO; the immunomodulation of murine macrophages treated with TrEO; and modulation of gene expression and cytokine production by murine macrophages treated with TrEO and infected with L. (L.) amazonensis. The effects of TrEO and TrROY on Leishmania promastigotes were evaluated using three methods, the conventional microscopic, reduction of XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-[(phenylamino), and transmission electron microscopy to check the ultrastructural alterations of promastigotes treated with TrEO. The TrEO and TrROY cytotoxicity was evaluated using the XTT method and Trypan Blue exclusion test, and for human erythrocytes was performed hemolysis test from reading in spectrophotometer. To check the effects of TrEO and TrROY on intracellular forms of Leishmania, peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice were infected with promastigotes, and subsequently treated with TrEO and TrROY. The percentage of infected cells and the average number of amastigotes per macrophage was obtained counting cells in conventional light microscopy. Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) was also performed to determine the quantity of parasites based on the Leishmania DNA detection. For studies of immunomodulation, murine peritoneal macrophages were infected with Leishmania, and treated with 30 ng/mL of TrEO. After 3, 6 and 24 hours of incubation, nitrite production was determined by spectrometry using the Griess reagent, and expression of iNOS and cytokines (interleukins, IL-1β, IL -2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL- 18, IL-33, interferon-γ, IFN-γ, tumor necrosis factor, TNF; growth factor of colonies of granulocytes and macrophages, GM-CSF) was measured by semi-quantitative PCR method associated with the reverse transcriptase. Cytokine production was detected by flow cytometry. For statistical analysis it was considered a 95% confidence interval. TrEO and TrROY promote the L. (L.) amazonensis promastigote forms death within 72 h of incubation. TrEO was more effective than TrROY, which the 50% lethal dose (LD50) of TrEO was 0.8 μg/mL and TrROY 3 μg/mL. TrEO and TrROY did not show cytotoxicity on human erythrocytes, but TrROY showed toxicity to murine macrophages resulting in a low selectivity index. TrEO at the concentration of 0.03 μg/mL was able to modify the ultrastructures of the promastigotes suggesting autophagy process and cell death indicated by the presence of chromatin condensation, membrane blebbing formation, membranous profiles and nuclear fragmentation. Macrophages treated with 0.03 μg/mL of TrEO and 10 μg/ml of TrROY reduced the infection index from 177 (macrophages infected with Leishmania) to 65 and 48%, respectively. TrEO and TrROY subvert the inhibition of expression of iNOS and nitrite production in macrophages infected with Leishmania. TrEO modulated cytokine gene expression and synthesis by murine macrophage uninfected and treated in all periods studied. The modulation of gene expression occurred only at 3 and 6 h, while the effects on cytokine production were observed up to 24 h. The expression and production 1β, IL-12, IL-17 and IFN-γ were highly induced by TrEO at 3 h. IL-1β was expressed and produced in high levels in 6 h, which was gradually reduced to the period of 24 h. IL-2 was produced at high levels at the start of incubation, and GM-CSF and IL-17 later (24 h). TrEO significantly inhibited IL- 10 and IL-6 production by murine macrophages. In macrophages infected with Leishmania, and treated with TrEO, IFN-γ was highly produced, and IL-1β, IL-6, IL-17, IL-33, TNF, and TH2-type cytokine response (helper T lymphocytes, IL-4, IL-5 and IL-10) were inhibited. IL- 12 levels were maintained at normal levels by treatment with TrEO. While infection with L. (L.) amazonensis stimulated IL-10 production, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 and IL-33, and inhibit IL-12 and IFN-γ produced by macrophages infected and not treated, TrEO treatment subvert it favoring the infection resolution. TrEO and TrROY promote the death of L. (L.) amazonensis possibly by mitochondrial, respiratory and lipid metabolism. TrEO at low concentrations did not show cytotoxicity to cells and is capable of modulating gene expression and production of major cytokines of the immune response. The profile of cytokines induced by TrEO in the absence of infection is associated with stimulation of the innate cellular immune response and suppression of TH2 cell cytokines. Thus, TREO would be an alternative therapy for various diseases in which the immune response is crucial for its resolution as in infectious diseases, autoimmune and cancer. The effects of TrEO on leishmaniasis, suggests that it is able to suppress TH2 cytokines involved with the progression of leishmaniasis, and enhances IFN-γ which is essential for the resolution of this disease. All these results support the use of T. riparia plant as a folk medicine for the treatment of parasitic infections such as leishmaniasis and other diseases which require modulation of the immune response. TrEO could be used as an alternative therapy for leishmaniasis. We suggested that in vivo tests in humans are performed to ensure its efficacy and safe use of this treatment for leishmaniasis or other disease.
Data da defesa: 17/07/2015
Cdigo: vtls000220769
Informaes adicionais:
Idioma: Portugus
Data de Publicao: 2015
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Maria Valdrinez Campana Lonardoni
Instituio: Universidade Estadual de Maring. Centro de Cincias da Sade
Nvel: Tese (doutorado em Cincias da Sade)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: Izabel Demarchi.pdf
Tamanho: 3794 Kb (3885041 bytes)
Criado: 18-05-2016 16:37
Atualizado: 18-05-2016 17:23
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