Resumo: A formação de vesículas de membrana é um processo ubíquo em bactérias Gramnegativas e Gram-positivas. O número de pesquisas em relação as vesículas de membrana aumentou na última década, entretanto o foco são àquelas realacionadas a patógenos humanos. Além disso, na maioria dos estudos apenas culturas puras são utilizadas. Com o avanço da proteômica, várias funções foram atribuídas às vesículas de membrana. No entanto, até o momento nenhum estudo isolou vesículas de membrana do líquido ruminal, nem avaliou a possível capacidade de hidrolisar substratos. Assim, como primeiro estudo, vesículas de membrana externa foram isoladas de uma cultura axênica de Prevotella ruminicola, por meio de protocolo usualmente empregado para isolar vesículas de membrana externa em bactérias patogênicas, para avaliar a atividade hidrolítica das amostras. O protocolo foi empregado com sucesso e nenhuma contaminação bacteriana foi observada quando se utilizou microscopia de transmissão eletrônica de seção transversal. Foram distintos os perfis de proteínas da cultura pura, células lavadas, sobrenadante livre de vesículas e vesículas de membrana externa, como observado por SDS-PAGE. Atividade proteolítica foi avaliada em zimograma de gelatina e amostras de vesículas de membrana externa apresentaram bandas distintas e nítidas em relação à cultura pura, células lavadas e sobrenadante livre de vesículas. Inibidores de protease foram adicionados às amostras, mas nenhum efeito claro pôde ser observado. Nenhuma atividade pôde ser observada em zimogramas de carboximetilcelulose e amido. Embora fosse esperada maior atividade enzimática, os resultados fornecem evidências de que algumas enzimas de P. ruminicola são seletivamente transportadas nas vesículas de membrana externa. Como segundo estudo, as vesículas de membrana foram isoladas utilizando líquido ruminal e material sólido do rúmem. Foram separadas as frações de bactérias anexas à fibra e bactérias associadas ao líquido para melhorar a caracterização das vesículas de membrana. Três vacas foram amostradas, mas apenas amostras de uma vaca foram utilizadas para gerar imagens de microscopia eletrônica de transmissão com coloração negativa. O perfil proteico foi semelhante entre as amostras quando avaliado em SDS-PAGE, mas a atividade proteolítica foi bastante diversa quando observado em zimogramas de gelatina e caseína. Ainda, a atividade em zimogramas com carboximetilcelulose e amido foi bastante diversa em todas as amostras. Estes resultados fornecem evidência de que vesículas de membrana no rúmen foram negligenciados pois em alguns casos houve mais atividade enzimática nas amostras de membranas de vesícula quando comparado com microrganismos somente. Compreender os fundamentos do microbioma é ponto chave para melhorar o uso de alimentos por ruminantes e pesquisas que utilizam vesículas de membrana isoladas do rúmen pode agregar conhecimento sobre as interações de microrganismos no rúmem.
Abstract: Membrane vesicles production is a ubiquitous process in Gram-negative and rampositive bacteria. Research on membrane vesicles increased during the last 10 years, but it is mainly focused on human pathogens. Also, in most studies only bacterial pure cultures are investigated. With the advance of proteomics, several new functions are now associated with membrane vesicles. Yet, so far no study has isolated membrane vesicles from rumen fluid, or assessed their capacity to hydrolase substrate. Thus, as a first study, outer membrane vesicles were isolated from an axenic culture of Prevotella ruminicola, using a protocol used to isolate outer membrane vesicles from pathogenic bacteria, and hydrolytic activity from the samples was assessed. The protocol was successfully employed as no bacterial contamination was observed on cross-section transmission electron microscopy. The protein profile from the whole culture, washed culture, outer membrane vesicle-free supernatant, and outer membrane vesicles were distinct as observed on SDS-PAGE. Proteolytic activity was assessed on gelatin zymograms and outer membrane vesicle samples had distinct and clearer bands compared to whole culture, washed culture, and outer membrane vesicle-free supernatant. Protease inhibitors to assess protease classes were added to the samples but no clear effect could be observed. Furthermore, no activity could be observed on carboxymethylcellulose and starch zymograms. Although a greater enzymatic activity was expected, results provide evidence that some proteolytic enzymes from P. ruminicola are selectively loaded into outer membrane vesicles from this bacterium. As a second study, membrane vesicles were isolated using rumen liquor and particulate matter from the rumen. Fractions using solid-attached bacteria and liquid-associated bacteria were used to further improve membrane vesicle characterization. Three cows were sampled but only samples from one cow were imaged with negative staining transmission electron microscopy. Protein profiles of samples were similar when assessed on SDS-PAGE, but proteolytic activity was diverse on gelatin and casein zymograms. Furthermore, activity on carboxymethylcellulose and starch zymograms was diverse across the samples. These results provide evidence that membrane vesicles in the rumen have been overlooked as in some cases more activity was observed in vesicle samples compared to within the microorganisms. Understanding fundamentals from microbiome is key to improve feed use in ruminants and research using membranes vesicles isolated from the rumen might add knowledge on rumen microbiome function. |