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Consultar: Programa de Ps-Graduao em Zootecnia

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Ttulo [PT]: Vesculas de membrana : um componente inexplorado no rmem com capacidade de degradao de protenas, carboximetilcelulose e amido
Autor(es): Rodolpho Martin do Prado
Palavras-chave [PT]:

Amilase. Celulase. Prevotella ruminicola. Protease. Vesculas de membrana. Vesculas de membrana externa. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Amylase. Cellulase. Membrane vesicle. Outer membrane vesicle. Prevotella ruminicola. Protease. Brazil.
rea de concentrao: Produo Animal
Titulao: Doutor em Zootecnia
Banca:
Geraldo Tadeu dos Santos [Orientador] - UEM
Jane Martha Graton Mikcha - UEM
Lcia Maria Zeoula - UEM
Sharon Ann Huws - UEM
Ricardo Kazama - UEM
Resumo:
Resumo: A formao de vesculas de membrana um processo ubquo em bactrias Gramnegativas e Gram-positivas. O nmero de pesquisas em relao as vesculas de membrana aumentou na ltima dcada, entretanto o foco so quelas realacionadas a patgenos humanos. Alm disso, na maioria dos estudos apenas culturas puras so utilizadas. Com o avano da protemica, vrias funes foram atribudas s vesculas de membrana. No entanto, at o momento nenhum estudo isolou vesculas de membrana do lquido ruminal, nem avaliou a possvel capacidade de hidrolisar substratos. Assim, como primeiro estudo, vesculas de membrana externa foram isoladas de uma cultura axnica de Prevotella ruminicola, por meio de protocolo usualmente empregado para isolar vesculas de membrana externa em bactrias patognicas, para avaliar a atividade hidroltica das amostras. O protocolo foi empregado com sucesso e nenhuma contaminao bacteriana foi observada quando se utilizou microscopia de transmisso eletrnica de seo transversal. Foram distintos os perfis de protenas da cultura pura, clulas lavadas, sobrenadante livre de vesculas e vesculas de membrana externa, como observado por SDS-PAGE. Atividade proteoltica foi avaliada em zimograma de gelatina e amostras de vesculas de membrana externa apresentaram bandas distintas e ntidas em relao cultura pura, clulas lavadas e sobrenadante livre de vesculas. Inibidores de protease foram adicionados s amostras, mas nenhum efeito claro pde ser observado. Nenhuma atividade pde ser observada em zimogramas de carboximetilcelulose e amido. Embora fosse esperada maior atividade enzimtica, os resultados fornecem evidncias de que algumas enzimas de P. ruminicola so seletivamente transportadas nas vesculas de membrana externa. Como segundo estudo, as vesculas de membrana foram isoladas utilizando lquido ruminal e material slido do rmem. Foram separadas as fraes de bactrias anexas fibra e bactrias associadas ao lquido para melhorar a caracterizao das vesculas de membrana. Trs vacas foram amostradas, mas apenas amostras de uma vaca foram utilizadas para gerar imagens de microscopia eletrnica de transmisso com colorao negativa. O perfil proteico foi semelhante entre as amostras quando avaliado em SDS-PAGE, mas a atividade proteoltica foi bastante diversa quando observado em zimogramas de gelatina e casena. Ainda, a atividade em zimogramas com carboximetilcelulose e amido foi bastante diversa em todas as amostras. Estes resultados fornecem evidncia de que vesculas de membrana no rmen foram negligenciados pois em alguns casos houve mais atividade enzimtica nas amostras de membranas de vescula quando comparado com microrganismos somente. Compreender os fundamentos do microbioma ponto chave para melhorar o uso de alimentos por ruminantes e pesquisas que utilizam vesculas de membrana isoladas do rmen pode agregar conhecimento sobre as interaes de microrganismos no rmem.

Abstract: Membrane vesicles production is a ubiquitous process in Gram-negative and rampositive bacteria. Research on membrane vesicles increased during the last 10 years, but it is mainly focused on human pathogens. Also, in most studies only bacterial pure cultures are investigated. With the advance of proteomics, several new functions are now associated with membrane vesicles. Yet, so far no study has isolated membrane vesicles from rumen fluid, or assessed their capacity to hydrolase substrate. Thus, as a first study, outer membrane vesicles were isolated from an axenic culture of Prevotella ruminicola, using a protocol used to isolate outer membrane vesicles from pathogenic bacteria, and hydrolytic activity from the samples was assessed. The protocol was successfully employed as no bacterial contamination was observed on cross-section transmission electron microscopy. The protein profile from the whole culture, washed culture, outer membrane vesicle-free supernatant, and outer membrane vesicles were distinct as observed on SDS-PAGE. Proteolytic activity was assessed on gelatin zymograms and outer membrane vesicle samples had distinct and clearer bands compared to whole culture, washed culture, and outer membrane vesicle-free supernatant. Protease inhibitors to assess protease classes were added to the samples but no clear effect could be observed. Furthermore, no activity could be observed on carboxymethylcellulose and starch zymograms. Although a greater enzymatic activity was expected, results provide evidence that some proteolytic enzymes from P. ruminicola are selectively loaded into outer membrane vesicles from this bacterium. As a second study, membrane vesicles were isolated using rumen liquor and particulate matter from the rumen. Fractions using solid-attached bacteria and liquid-associated bacteria were used to further improve membrane vesicle characterization. Three cows were sampled but only samples from one cow were imaged with negative staining transmission electron microscopy. Protein profiles of samples were similar when assessed on SDS-PAGE, but proteolytic activity was diverse on gelatin and casein zymograms. Furthermore, activity on carboxymethylcellulose and starch zymograms was diverse across the samples. These results provide evidence that membrane vesicles in the rumen have been overlooked as in some cases more activity was observed in vesicle samples compared to within the microorganisms. Understanding fundamentals from microbiome is key to improve feed use in ruminants and research using membranes vesicles isolated from the rumen might add knowledge on rumen microbiome function.
Data da defesa: 10/07/2015
Cdigo: vtls000224166
Informaes adicionais:
Idioma: Portugus
Data de Publicao: 2015
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Tadeu dos Santos
Co-Orientador: Prof. Dr. Sharon Ann Huws
Instituio: Universidade Estadual de Maring. Centro de Cincias Agrrias
Nvel: Tese (doutorado em Zootecnia)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Zootecnia

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: 150913 Tese.pdf
Tamanho: 6106 Kb (6252272 bytes)
Criado: 09-11-2016 18:29
Atualizado: 09-11-2016 18:43
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