Resumo: Inativação fotodinâmica (PDI) é uma nova e promissora estratégia para erradicar microrganismos, tais como bactérias Gram positivas e Gram negativas, leveduras, bolores, vírus e parasitas. Esta técnica baseia-se na utilização de fotossensibilizadores (FS) ativados por uma luz de comprimento de onda apropriado. Entre os fotossensibilizadores naturais, a curcumina é um pigmento amarelo isolado a partir de Curcuma longa e tem sido utilizado como uma especiaria desde os tempos antigos. Entre as suas diversas atividades biológicas estão as suas propriedades antioxidante, antimicrobiana, anti-HIV, anti-inflamatória e anti-cancerígena. A curcumina absorve luz azul em uma faixa de espectro de absorção de 400-500 nm. Foi relatada a utilização de fotossensibilização mediada por curcumina contra uma gama de bactérias e fungos. Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro da terapia fotodinâmica contra bactérias patogênicas e deteriorantes usando curcumina como um fotossensibilizador. Curcumina a 75 μM foi usada como fotossensibilizador nos experimentos de inativação fotodinâmica. A fonte de luz utilizada foi LED azul (λmáx = 470 nm) e as doses de luz foram calculadas para os períodos de 10 e 20 minutos de iluminação. A padronização das suspensões bacterianas da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus ATCC 25923 e das bactérias Gram-negativas Aeromonas hydrophila ATCC 7966; Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella enterica sorotipo Typhimurium ATCC 14028 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foi realizada em solução salina estéril 0,85%, utilizando escala de McFarland 0,5 e estas foram diluídas a aproximadamente 107 UFC/ml para utilização nos experimentos. Alíquotas de 50 μl das suspensões bacterianas padronizadas foram incubadas com 950 μl de solução de curcumina a 75 μM no escuro durante 10 minutos. Após a incubação, 500 μl da amostra foram iluminados com um diodo emissor de luz azul. Dois períodos de exposição à luz, 10 e 20 minutos, foram avaliados, e o controle foi avaliado sem exposição à luz. Em seguida diluições em série das amostras tratadas e do controle foram semeadas em ágar tripticase de soja (TSA; Difco) e incubadas a 37°C/24h. A contagem das colônias foi realizada e os resultados de viabilidade celular foram expressos em log UFC/ml. As alterações morfológicas de S. aureus e A. hydrophila induzidas por PDI mediada por curcumina a 75 μM e irradiação por luz LED azul por 10 minutos foram examinadas por microscopia eletrônica de varredura. Citotoxicidade da PDI mediada por curcumina foi avaliada utilizando células VERO, em condições similares às da fotoinativação bacteriana. As doses de luz obtidas foram 139 J/cm2 durante 10 minutos e 278 J/cm² durante 20 minutos de iluminação. Curcumina a 75 μM na ausência de ativação de luz não reduziu as contagens bacterianas e a exposição da bactéria somente à luz LED azul não teve nenhum efeito sobre a sua viabilidade. PDI mediada por curcumina a 75 μM em S. aureus revelaram diferenças significantes na viabilidade celular em comparação com o grupo controle (p < 0,05). A exposição à luz LED azul durante 10 minutos mostrou uma redução de aproximadamente 3,27 log UFC/ml enquanto que após 20 minutos, uma redução de aproximadamente 3,57 log UFC/ml foi observada. Entre as bactérias Gram negativas avaliadas, A. hydrophila mostrou maior sensibilidade ao tratamento. Uma redução significante (p < 0,05) de 3.33 log UFC/ml nas contagens foi observada depois de 10 minutos (139 J/cm2) de exposição. Além disso, fotoinativação completa foi obtida depois de 20 minutos (278 J/cm2) de exposição à luz. Reduções de 1,29 (p > 0,05) e 2,65 (p < 0,05) log UFC/ml foram obtidos para E. coli em doses de luz de 139 e 278 J/cm2, respectivamente, e para S. Typhimurium as reduções foram de aproximadamente 1,26 e 1,81 log UFC/ml (p > 0,05), para 10 e 20 minutos de exposição à luz LED azul, respectivamente. O tratamento contra P. aeruginosa exerceu efeitos antimicrobianos limitados, resultando em apenas 0,24 e 0,3 log UFC/ml de redução com 10 e 20 minutos de exposição, respectivamente. Bactérias Gram-negativas são significativamente mais resistentes à PDI do que espécies Gram-positivas, uma vez que apresentam uma membrana externa complexa que funciona como uma barreira física e funcional entre as células e o meio ambiente, enquanto que a maioria das células de bactérias Gram-positivas tem uma parede celular com um grau relativamente elevado de porosidade e permeabilidade. A presença de uma camada S em A. hydrophila poderia explicar a sensibilidade e os melhores resultados para PDI por curcumina. As alterações morfológicas de S. aureus induzidas por PDI mediada por curcumina mostram uma superfície de células lisas quando S. aureus foi incubado com a curcumina no escuro, sem exposição ao LED, e com o tratamento com curcumina e irradiação por 10 minutos, a membrana celular apresentou distorções e enrugamento. As alterações morfológicas de A. hydrophila induzidas por PDI mediada por curcumina mostraram a membrana celular com distorções e saliência de pequenas bolhas para o tratamento no tempo de irradiação de 10 minutos, enquanto o controle mostrou uma superfície de células lisas. A citotoxicidade da PDI mediada por curcumina em células VERO mostrou uma porcentagem de destruição das células de 13 ± 0,05%, para ambos os tempos de iluminação (10 e 20 minutos). Os ensaios de citotoxicidade são importantes para investigar os potenciais efeitos tóxicos da terapia fotodinâmica no tratamento das células hospedeiras e para evitar danos para as funções celulares básicas. Um FS ideal deve apresentar nenhuma toxicidade para as células hospedeiras e possuir atividade antimicrobiana. A inativação fotodinâmica mediada por curcumina foi eficaz na redução das contagens bacterianas. A. hydrophila e S. aureus foram mais susceptíveis e P. aeruginosa foi a bactéria mais resistente ao tratamento. Inativação fotodinâmica poderia servir como uma abordagem nova e promissora para controlar bactérias patogênicas de importância alimentar e deteriorantes de alimentos.
Abstract: Photodynamic inactivation (PDI) is a new and promising strategy to eradicate microorganisms such as Gram positive and Gram negative bacteria, yeasts, molds, viruses and parasites. This technique is based on the use of photosensitizer’s (PSs) activated by an appropriate wavelength light. Among naturally occurring PSs, curcumin is a yellow pigment isolated from Curcuma longa and has been used as a spice since ancient times. Among its many biological activities are its antioxidant, antimicrobial, anti-HIV, anti-inflammatory and anticancer properties. The use of curcumin-mediated photosensitization has been reported against a range of bacteria and fungi. Evaluate antimicrobial photodynamic activity in vitro against pathogenic and spoilage bacteria using curcumin as a photosensitizer. Curcumin at 75 μM was used as a photosensitizer in the photodynamic inactivation experiments. The light source used was blue LED (λmax = 470 nm) and the light doses were calculated for the periods of 10 and 20 minutes of illumination. Standardized bacterial suspensions of Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus ATCC 25923 and the Gram-negative bacteria Aeromonas hydrophila ATCC 7966; Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella enterica serotype Typhimurium ATCC 14028 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 were made in 0.85% sterile saline using a McFarland Scale 0.5 and diluted to approximately 107 CFU/ml for use in the experiments. Aliquots of 50 μl of standardized bacterial suspension were incubated with 950 μl of curcumin solution at 75 μM in the dark for 10min. After incubation, 500 μl of the sample was illuminated with a blue LED. Two light exposure periods, 10 and 20 minutes, were evaluated, and the control was evaluated without light exposure. Afterwards serial dilutions of the treated and control samples were inoculated in trypticase soy agar (TSA; Difco) plates and incubated at 37°C/24h. The counting of colonies was carried out and the results of cell viability were expressed as log CFU/ml. The morphological changes of S. aureus and A. hydrophila induced by PDI with curcumin at 75 μM and irradiation by blue LED light for 10 minutes were examined by scanning electron microscopy. Cytotoxicity of PDI mediatedcurcumin was evaluated using VERO cells, in similar conditions to bacterial photoinactivation. Light doses obtained were 139 J/cm² for 10 minutes of illumination and 278J/cm² for 20 minutes. Curcumin at 75 μM in the absence of light activation did not reduce bacterial counts and the exposure of the bacteria to blue led light had no effect on its viability. PDI mediated by curcumin at 75 μM in S. aureus revealed significant differences in cell viability compared with the control group (p < 0.05). Exposure to LED blue light for 10 minutes displayed a reduction of approximately 3.27 log CFU/ml while after 20 minutes a reduction of approximately 3.57 log CFU/ml was observed. Among evaluated Gram negative bacteria, A. hydrophila displayed more sensibility to the treatment. A significant decrease (p < 0.05) in counts of 3.33log CFU/ml was observed after 10 minutes (139 J/cm2) of exposure. Additionally, complete photoinactivation was obtained after 20 minutes (278 J/cm2) of exposure to light. Reductions of 1.29 (p > 0.05) and 2.65 (p < 0.05) log CFU/ml were obtained for E. coli in light doses of 139 and 278 J/cm2, respectively and for S. Typhimurium the reductions were approximately 1.26 and 1.81 log CFU/ml (p>0.05), for 10 and 20 minutes of exposure to blue LED light, respectively. The treatment against P. aeruginosa exerted limited antimicrobial effects, resulting in only 0.24 and 0.3 log CFU/ml reductions with 10 and 20 minutes of exposure, respectively. Gram negative bacteria are significantly more resistant to PDI than Gram positive species, since present a complex outer membrane that work as a physical and functional barrier between the cells and the environment, while most Gram positive bacteria cells have a cell wall with a relatively high degree of porosity and permeability. The presence of S-layer in A. hydrophila could explain the sensibility and the best results to PDI by curcumin. The morphological changes of S. aureus induced by curcumin-mediated PDI showed a smooth cell surface when S. aureus was incubated with curcumin in the dark without LED exposure and with curcumin LED-irradiated for 10 minutes the cell membrane presented distortions and seemed shriveled and wrinkled. The morphological changes of the A. hydrophila induced by curcumin-mediated PDI showed the cell membrane with distortions and protrusion of small bubbles for the treatment at irradiation time of 10min while the control showed a smooth cell surface. The cytotoxicity of PDI mediated-curcumin in VERO cells showed a percentage of cell destruction of 13±0.05%, for both illumination times (10 and 20 minutes). Cytotoxicity assays are important for investigating the potential toxic effects of photodynamic therapy on the host cells and to avoid damage to basic cellular functions. An ideal PS should present no toxicity for the host cells and possess biological antimicrobial activity. The PDI by curcumin was effective in reducing bacterial counts. A. hydrophila and S. aureus were the most susceptible and P. aeruginosa was the most resistant to PDI. Photodynamic inactivation could serve as a new and promising approach to controlling foodborne and food spoilage bacteria. |