Biblioteca Digital da UEM: Sistema Nou-Rau
Pgina Principal  Portugus   English  Español   Aumentar Texto  Texto Normal  Diminuir Texto
  Principal | Apresentao | Objetivos | Instrues Autores | Estatsticas | Outras Bibliotecas Digitais
  Sistema Integrado de Bibliotecas - SIB / UEM
Entrar | acessos | verso 1.1  
ndice
Pgina principal
Documentos
Novidades
Usurios

Aes
Consultar
Procurar
Exibir estatsticas

Procurar por:
Procura avanada

Dvidas e sugestes


Consultar: Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Biologia Celular)

Incio > Dissertaes e Teses > Cincias Biolgicas > Biologia Geral > Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Biologia Celular)

Ttulo [PT]: Morte celular de leishmania amazonensis induzida por (1E,4E)-2-metil-1,5-bis(4-nitrofenil)penta-1,4-dien-3-ona e desenvolvimento de nanogis a base de cido hialurnico como carreadores de substncias hidrofbicas bioativas
Autor(es): Francielle Pelegrin Garcia Geremias
Palavras-chave [PT]:

Leishmania amazonensis. Leishmaniose. Protozologia. Nanotecnologia. Morte celular. Apoptose. Nanogis termossensveis. Crosslinking. Drug-delivery. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Leishmania amazonensis. Leishmaniasis. Cell death. Apoptosis. Thermosensitive nanogels. Crosslinking. Drug-delivery. Brazil.
rea de concentrao: Biologia Celular e Molecular
Titulao: Doutor em Cincias Biolgicas
Banca:
Celso Vataru Nakamura (Orientador) - UEM
Rachel Auzly-Velty - UGA/Frana
Sueli Fumie Yamada Ogatta - UEL
Mirian Ueda Yamaguchi - UNICESUMAR
Alessandro Francisco Martins - UTFPR
Resumo:
Resumo: As leishmanioses so um complexo de doenas com importante espectro clnico e diversidade epidemiolgica, representando um grave problema de sade pblica em todo o mundo. Por se tratar de uma doena negligenciada, apesar do progresso em conhecimentos fundamentais sobre o parasito, o tratamento atual contra a leishmaniose ainda insatisfatrio, devido eficcia limitada, aumento de casos de resistncia, alm do longo tempo de tratamento e efeitos colaterais. Assim, considerando o potencial antileishmania j descrito para derivados de chalconas, a substncia (1E,4E)-2-metil-1,5-bis(4-nitrofenil)penta-1,4-dien-3-ona (A3K2A3) apresentou-se como uma candidata promissora em testes in vitro preliminares. Neste contexto, desenvolvemos um estudo mais aprofundado dessa atividade, bem como de seu possvel mecanismo de ao associado a morte celular dos parasitos. Entretanto, este derivado de chalcona, bem como parte considervel das novas substncias, apresentam elevada hidrofobicidade, a qual normalmente se associam diversos problemas de administrao in vivo, como baixa absoro e biodisponibilidade sistmica, agregao intravenosa, entre outros efeitos, podendo limitar seu potencial biolgico. Dessa forma, para se obter um melhor resultado no tratamento contra as doenas infecciosas necessrio no apenas investigar novos compostos que possuam potencial teraputico, mas tambm incorpor-los a novas tecnologias, tais como nanopartculas, as quais permitam um aumento da atividade biolgica, maior biodisponibilidade e estabilidade em meio fisiolgico, alm de reduo de possveis efeitos colaterais e uma melhor abordagem teraputica aos pacientes. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a realizao de um estudo in vitro para compreender a atividade e o mecanismo de ao da substncia A3K2A3 envolvido na morte celular desses parasitos bem como o desenvolvimento de nanogis a base de cido hialurnico como carreadores de substncias hidrofbicas para clulas alvo. Inicialmente, foram realizados estudos da atividade de A3K2A3 sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis e ainda sua citotoxicidade in vitro sobre hemcias. Resultados comprovaram a atividade dessa substncia sobre as duas formas evolutivas do parasito, assim como sua baixa toxicidade. Alm disso, promastigotas tratadas por 24 h com A3K2A3 nas concentraes de 3.4 e 9.3 μM (correspondentes s concentraes de IC50 e IC90, respectivamente) foram utilizadas para a avaliao do possvel mecanismo de ao dessa substncia. Inicialmente, por meio de tcnicas de microscopia eletrnica de transmisso, alteraes ultraestruturais foram observadas, revelando principalmente danos mitocondriais e no ncleo, bem como acmulo de corpos lipdicos. Adicionalmente, tcnicas envolvendo fluorimetria e citometria de fluxo foram utilizadas para investigar as causas dessas alteraes. Os resultados obtidos sugerem que o efeito antileishmania de A3K2A3 provocou morte celular via apoptose que foi inicialmente causada por um aumento nos nveis de espcies reativas de oxignio dentro das clulas. Este aumento foi provavelmente responsvel pelo colapso do potencial da membrana mitocondrial e pela reduo dos nveis de ATP. O tratamento com A3K2A3 tambm desencadeou a externalizao da fosfatidilserina, diminuio do volume celular, ativao de caspases, induo da fragmentao do DNA, alteraes compatveis com a morte celular por apoptose. A segunda parte desse estudo foi o desenvolvimento dos nanogis a base de cido hialurnico (AH). Para isso, cadeias de copolmeros termorresponsveis, poli(DAAM-co-DMA), contendo grupos reticulveis foram grafadas na cadeia de AH por qumica de tiol-eno. O derivado de AH obtido foi caracterizado por ressonncia magntica nuclear de hidrognio, permitindo confirmar a reao de acoplamento e determinar a quantidade de cadeias de copolmero grafadas no polissacardeo. Verificou-se que o produto AH-m-poli(DAAM-co-DMA), quando aquecido acima de 32 C foi capaz de se autoassociar formando nanogis esfricos com um dimetro em torno de 150 nm e um ndice de polidisperso de 0,1. Este processo, porm, reversvel quando se diminui a temperatura abaixo da LCST (temperatura crtica da soluo) do copolmero (LCST = 24 C). Em seguida, a fim de obter nanogis mais estveis, estes foram submetidos a uma reao de reticulao utilizando o cido isofitlico diidrazida (IDH). Este foi adicionado a uma soluo de nanogis a 40 C, em condies fisiolgicas e a reao entre os grupos ceto-funcionais do copolmero e a diidrazida bifuncional ocorreu espontaneamente por aproximadamente 24 h. Trs concentraes de IDH foram utilizadas (0.5, 1.0 e 1.5 equivalentes molares) para garantir a eficincia da reticulao. Aps reao de reticulao, a estrutura dos nanogis tornou-se estabilizada por meio das ligaes hidrazonas formadas, mesmo em baixa temperatura. Nanogis no reticulados e reticulados foram ento caracterizados por meio de diferentes tcnicas a fim de verificar tamanho, forma e confirmar as reaes de reticulao realizadas por meio de tcnicas de espalhamento de luz (DLS), microscopia eletrnica de varredura e criomicroscopia eletrnica. Nanogis no reticulados e reticulados foram ainda utilizados para encapsular molculas hidrofbicas ativas, como o paclitaxel (agente anticancer). Foram tambm avaliadas a citotoxicidade em clulas tumorais (in vitro) e a biodistribuio dos nanogis reticulados em um modelo tumoral xenogrfico (TSA-pc). Os nanogis apresentaram uma boa biocompatibilidade, e foram capturados por clulas tumorais. Alm disso, foram capazes de circular por at 48 h no corpo do animal e ainda de se acumular no local do tumor. A substncia A3K2A3 induziu a morte celular nos protozorios tratados via disfuno mitocondrial, exibindo vrias caractersticas indicativas de apoptose, incluindo o aumento de espcies reativas de oxignio, despolarizao mitocondrial, aumento na exposio de fosfatidilserina, reduo do volume celular, e fragmentao do DNA. O estudo das principais vias envolvidas na morte dos protozorios fornece informaes valiosas para o desenvolvimento de novas estratgias quimioterpicas. Alm disso, nanogis foram sintetizados a partir do AH modificado e puderam ser obtidos facilmente por auto associao desencadeada por temperatura, tendo sua estabilidade em meio fisiolgico aumentada pela reticulao dos nanodomnios hidrofbicos das cadeias de copolmero. A reticulao no afetou a eficincia de encapsulao das partculas e as propriedades biocompatveis inerentes ao AH. Estes resultados sugerem que esses nanogis possuem grande potencial como nanocarreadores de molculas bioativas sendo promissores para o tratamento do cncer bem como de outras doenas infecciosas como as leishmaninoses.

Abstract: Leishmaniasis is a complex of diseases with important clinical spectrum and epidemiological diversity, representing a serious public health problem worldwide. Because it is a neglected disease, despite progress in fundamental knowledge about the parasite, current treatment against leishmaniasis is still unsatisfactory due to limited efficacy, increased cases of resistance, in addition to long treatment time and side effects. Thus, considering the antileishmanial potential already described for chalcone derivatives, the substance (1E, 4E) -2-methyl-1,5-bis (4-nitrophenyl) penta-1,4-dien-3-one (A3K2A3) presented as a promising candidate in preliminary in vitro tests. In this context, we have developed a detailed study of this activity, as well as its possible mechanism of action associated with parasite cell death. However, this chalcone derivative, as well as a considerable part of the new substances, presents high hydrophobicity, which is usually associated with several problems of in vivo administration, such as low absorption and systemic bioavailability, intravenous aggregation, among other effects, being able to limit its biological potential. Thus, in order to obtain a better result in the treatment of infectious diseases, it is necessary not only to investigate new compounds that possess therapeutic potential, but also to incorporate them into new technologies, such as nanoparticles, which allow an increase in biological activity, greater bioavailability and stability in physiological conditions, besides reducing possible side effects and a better therapeutic approach to patients. In this context, the objective of this work was to perform an in vitro study to understand the activity and mechanism of action of A3K2A3 involved in the cell death of these parasites as well as the development of nanogels based on hyaluronic acid as carriers of hydrophobic substances for target cells. Initially, studies of the activity of A3K2A3 on promastigotes and intracellular amastigotes of Leishmania amazonensis and their cytotoxicity on red blood cells were performed. Results have confirmed the activity of this substance on the two evolutionary forms, as well as its low toxicity. In addition, promastigotes treated for 24 h with substance A3K2A3 at concentrations of 3.4 and 9.3 μM (corresponding to the concentrations of IC50 and IC90, respectively) were used to evaluate the possible mechanism of action of this substance. Initially, by means of transmission electron microscopy techniques, ultrastructural alterations were found, mainly revealing mitochondrial and nucleus damages, as well as accumulation of lipid bodies. In addition, techniques based on fluorimetry and flow cytometry were used to investigate the causes of these changes. The results obtained suggest that the antileishmanial effect of A3K2A3 caused cell death via apoptosis which was initially caused by an increase in the levels of reactive oxygen species within the cells. This increase was probably responsible for the collapse of mitochondrial membrane potential and the reduction of ATP levels. Treatment with A3K2A3 also triggered the externalization of phosphatidylserine, decreased cell volume, activation of caspases and DNA fragmentation, which are changes compatible with cell death through apoptosis. The second part of this study was the development of nanogels based on hyaluronic acid (HA). To this end, thermo-responsive poly(DAAM-co-DMA) copolymer chains containing crosslinkable groups were grafted on the HA chain by thiol-ene chemistry. The obtained HA derivative was characterized by 1H NMR, allowing to confirm the coupling reaction and to determine the amount of copolymer that were grafted on the polysaccharide. The HA-m-poly(DAAM-co-DMA), when heated above 32 C, was able to self-assemble into spherical nanogels with a diameter around 150 nm and a polydispersity index of 0.1. This process, however, is reversible when the temperature decreases below the LCST (lower critical solution temperature) of the copolymer (LCST = 24 C). Then, in order to obtain stabilized nanogels, they were subjected to a cross-linking reaction using isophtalic acid dihydrazide (IDH). It was added to a solution of nanogels at 40 C under physiological conditions and the reaction between the keto-functional groups of the copolymer and the bifunctional dihydrazide occurred spontaneously for approximately 24 h. Three concentrations of IDH were used (0.5, 1.0 and 1.5 molar equivalents) to ensure crosslinking efficiency. After core cross-linking reaction, the structure of the nanogels became stabilized through the formed hydrazone bonds, even at low temperature. Non-crosslinked and crosslinked nanogels were then characterized by different techniques (light scattering, scanning electron microscopy and electronic cryoscopy) in order to verify size, shape and to confirm the crosslinking reaction. Non-crosslinked and crosslinked nanogels were further used to encapsulate active hydrophobic molecule, such as paclitaxel (anticancer agent). Cytotoxicity in tumor cells (in vitro) and biodistribution of the crosslinked nanogels in a xenograft tumor model (TSA-pc) were also evaluated. The nanogels showed good biocompatibility, and were captured by tumor cells. In addition, they were able to circulate up to 48 h in mice body and still accumulate in the tumor site. A3K2A3 induced cell death in protozoa treated through mitochondrial dysfunction, exhibiting several characteristics indicative of apoptosis, including increased reactive oxygen species, mitochondrial depolarization, increased phosphatidylserine exposure, reduced cell volume, and DNA fragmentation. The study of the main pathways involved in the death of protozoa provides valuable information for the development of new chemotherapeutic strategies. In addition, nanogels were synthesized from hyaluronic acid modified with a ketone-functional copolymer and could be easily obtained by self-assembling triggered by temperature, with enhanced stability in physiological conditions through the core cross-linking of the hydrophobic nanodomains of the copolymer chains. Crosslinking did not affect either the encapsulation efficiency of the particles and the biocompatible properties inherent to HA. These results suggest that these nanogels have great potential as nanocarriers of bioactive molecules being promising for the treatment of cancer as well as for other infectious diseases such as leishmaniasis.
Data da defesa: 27/06/2017
Cdigo: vtls000227115
Informaes adicionais:
Idioma: mul
Data de Publicao: 2017
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias Biolgicas
Nvel: Tese (doutorado em Cincias Biolgicas)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: tese Francielle final.pdf
Tamanho: 2557 Kb (2618372 bytes)
Criado: 30-11-2017 20:08
Atualizado: 30-11-2017 20:22
Visitas: 355
Downloads: 17

[Visualizar]  [Download]

Todo material disponvel neste sistema de propriedade e responsabilidade de seus autores.