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Ttulo [PT]: Pseudomonas aeruginosa : genotipagem, alteraes estruturais e expresso gnica diferencial aps exposio combinao de meropenem e ciprofloxacino
Ttulo [EN]: Pseudomonas aeruginosa: Genotyping, Structural changes and differential gene expression after exposure to the meropenem and ciprofloxacin combination
Autor(es): Vera Lcia Dias Siqueira
Palavras-chave [PT]:

Pseudomonas aeruginosa. Multirresistncia antimicrobiana. Combinao antimicrobiana. Meropenem,.Ciprofloxacino. Expresso gnica. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Pseudomonas aeruginosa. Multidrug resistance. Antimicrobial combination. Meropenem. Ciprofloxacin. Gene expression. Brazil.
rea de concentrao: Produtos Naturais e Sintticos Biologicamente Ativos
Titulao: Doutor em Cincias Farmacuticas
Banca:
Celso Vataru Nakamura (Orientador) - UEM
Gerson Nakazato
Herida Regina Nunes Salgado
Maria Cristina Bronharo Tognim
Sueli Fumie Yamada Ogatta
Resumo:
Resumo: O uso de combinaes antimicrobianas para o tratamento de infeces por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes comum na prtica clnica. Entretanto, o mecanismo de ao destas associaes mantm-se em grande parte desconhecido. O presente estudo identificou alteraes estruturais e genes diferencialmente expressos decorrentes da exposio a concentraes subinibitrias de meropenem e ciprofloxacino isoladamente e em combinao (MCC) em um isolado clnico genotipicamente distinto de P. aeruginosa multirresistente (1071-MRPA). Os resultados deste trabalho foram compilados em dois manuscritos apresentados no captulo II. Inicialmente, P. aeruginosa isoladas de pacientes internados em um hospital universitrio de Maring, Paran, Brasil, entre janeiro de 2007 e julho de 2009, foram genotipadas pela tcnica enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR). Trinta e dois isolados genotipicamente distintos, multirresistentes e com resistncia a pelo menos um dos antimicrobianos estudados, foram selecionados para determinao in vitro da ao antimicrobiana de MCC. Esta combinao foi sinrgica para 25,0% e 40,6% dos isolados de P. aeruginosa testados por checkerboard e curva de tempo de morte, respectivamente. Posteriormente, foram avaliadas alteraes estruturais por microscopia eletrnica (varredura e transmisso) e alteraes na expresso gnica, por anlise da representao diferencial (Representational Difference Analysis, RDA) e PCR quantitativa em tempo real (qPCR), decorrentes da ao sinrgica de MCC em 1071-MRPA. Pela microscopia eletrnica, uma somatria das alteraes morfolgicas e estruturais observadas em 1071-MRPA expostas aos antimicrobianos isoladamente, foi visualizada nas clulas bacterianas expostas MCC. Entretanto, vesculas de membrana externa, normalmente relacionadas resposta SOS bacteriana e efeitos citotxicos no hospedeiro, foram observadas em maior nmero aps exposio ao ciprofloxacino e significantemente inibidas em MCC. Genes relacionados biossntese da parede celular e reparo de DNA, entre outros, foram diferencialmente expressos em 1071-MRPA exposta a meropenem, ciprofloxacino e MCC. Adicionalmente, as anlises por qPCR revelaram que alm dos genes diferencialmente expressos relacionados ao reparo de danos em parede celular e DNA, genes relacionados resistncia aos antimicrobianos estudados e regulao da resposta SOS bacteriana foram menos expressos durante a exposio MCC. Os resultados deste estudo sugerem que MCC pode ser uma alternativa para o tratamento de infeces por P. aeruginosa multirresistentes. Alm disso, os efeitos de MCC em 1071-MRPA podem no somente resultar da somatria dos efeitos dos antimicrobianos isoladamente, mas uma ao diferenciada, provavelmente no mecanismo de proteo bacteriana.

Abstract: The use of antimicrobial combinations for the treatment of Pseudomonas aeruginosa infection is common in clinical practice. However, the mechanism of action of these combinations remains largely unknown. The present study identified structural changes and differentially expressed genes in a genotypically distinct multi-drug resistant P. aeruginosa clinical isolate (1071-MRPA) caused by exposure to subinibitory concentrations of meropenem and ciprofloxacin alone and in combination (MCC). The results of this study were compiled into two manuscripts presented in Chapter II. Initially, P. aeruginosa isolates were obtained from patients in a university hospital in Maring, Paran, Brazil, from January 2007 to July 2009. The isolates were genotyped by enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR). Thirty-two genetically distinct multidrug-resistant P. aeruginosa isolates and P. aeruginosa isolates resistant to at least one of two antimicrobials, were selected for the in vitro determination of the antimicrobial action of the MCC. This combination was synergistic to 25.0% and 40.6% of the P. aeruginosa isolates tested by checkerboard and time-kill curve assays, respectively. Subsequently, because of the synergistic action of the MCC in 1071-MRPA, structural changes were assessed by scanning and transmission electron microscopy and gene expression using Representational Difference Analysis (RDA) and quantitative real-time PCR (qPCR). Electron microscopy indicated that the MCC caused a summation of the structural and morphological changes induced by the antimicrobials alone in 1071-MRPA. However, outer membrane vesicles that are normally related to the bacterial SOS response and cytotoxic effects in the host were greater amount with ciprofloxacin exposure and significantly inhibited in MCC-exposed cells. Genes related to cell-wall and DNA repair, among others, were differentially expressed in meropenem-, ciprofloxacin-, and MCC-exposed 1071-MRPA. Additionally, qPCR analysis revealed that besides of differentially expressed genes, associated with DNA and cell wall repair, genes related to bacterial SOS response regulation and antimicrobial resistance exhibited lower expression in MCC-exposed cells. The present study suggests that the MCC may be an alternative for the treatment of infections caused by P. aeruginosa. The effect of this antimicrobial combination may be not only the result of a summation of the effects of meropenem and ciprofloxacin but also a result of differential action that likely affects protective mechanisms in the bacteria.
Data da defesa: 05/07/2013
Cdigo: vtls000227560
Informaes adicionais:
Idioma: mul
Data de Publicao: 2013
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias da Sade
Nvel: Tese (doutorado em Cincias Biolgicas)
UEM: Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: Tese Vera Lcia Dias Siqueira 2013.pdf
Tamanho: 1956 Kb (2003364 bytes)
Criado: 17-01-2018 16:14
Atualizado: 17-01-2018 16:19
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