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Título [PT]: Produção de ciclodextrinas em reator de leito fluidizado com a enzima ciclodextrina glicosiltransferase imobilizada
Título [EN]: Production of cyclodextrins in a fluidized bed reactor with the immobilized enzyme cyclodextrin glycosyltransferase
Autor(es): Paulo Waldir Tardioli
Palavras-chave [PT]:

Enzima ciclodextrina glicosiltransferase, CGTase imobilizada, Ciclodextrina glicosiltransferase. Produção. Enzima CGTase. Produção.Ciclodextrinas. Brasil.

Flávio Faria de Moraes [Orientador] - UEM Gisella Maria Zanin - UEM Raquel de Lima Camargo Giordano - UFSCar

Resumo: As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, formados por um número variável de unidades de glicose, unidas entre si por ligações glicosídicas do tipo α - 1,4. As mais comuns são constituídas de 6, 7 e 8 unidades de glicose, sendo denominadas α-¬CD, β-CD e у-CD, respectivamente. São produzidas pela ação da enzima Ciclodextrina Glicosiltransferase (CGTase) sobre o amido previamente liqüefeito. Pelo fato de terem uma cavidade apoiar, que favorece a microencapsulação de uma grande variedade de moléculas orgânicas, apresentam diversas aplicações nas indústrias farmacêuticas, alimentícias, de cosméticos, entre outras. Neste trabalho, o objetivo principal foi estudar a produção de CDs em reator de leito fluidizado, em função do tempo de residência do substrato no leito de partículas, utilizando a CGTase imobilizada em sílica de porosidade controlada (SPC), com diâmetro médio de partículas da ordem de 0,42 mm. A CGTase originária do Bacillus alcalofílico sp. e clonada em Escherichia coli, foi fornecida pela WACKER, contendo 193,1 mg de proteína/g de enzima liofilizada e atividade específica de 63,1 μmoles de β-CD/(min. mg de proteína), determinada a 50°C e pH 8. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade bioespecífica, utilizando como suporte a Sepharose 6B e como ligante a β-CD . Em seguida a CGTase foi imobilizada em SPC pelo método da ligação covalente, utilizando-se glutaraldeído como reagente bifuncional. A purificação apresentou fator um de purificação igual a 1,2 e um rendimento em atividade de 72%. Do total de proteína submetida à purificação, 94% foi recuperada, sendo que deste total 65,3% correspondia à enzima CGTase. Obteve-se uma solução enzimática contendo 1,64 mg de proteína/mL de solução e atividade específica de 73,80 μmoles de β-CD/(min. mg de proteína). Na imobilização da CGTase, o rendimento de fixação de proteína foi igual a 28,96%, produzindo uma enzima imobilizada com 4,66 mg de proteína/g de suporte seco e uma atividade de 8,62 μmoles de β-CD/(min. gEI), o que corresponde a um rendimento em atividade de 2,53%. A recuperação da atividade total oferecida à imobilização foi igual a 28,68%. A produção de CDs foi conduzida a 50°C, variando-se a carga enzimática no reator e mantendo-se fixa a porosidade do leito fluidizado líquido-sólido em 0,5. O substrato utilizado foi uma solução de dextrina 10 (FLUKA) 100 g/L, contendo tampão tris-HCl, pH 8, 0,01 M e solução de cloreto de cálcio 5 mM. As amostras foram coletadas no efluente do reator e as concentrações de β-CD e у-CD foram determinadas pelos métodos colori métricos da fenolftaleína e do verde de bromocresol. A conversão máxima de dextrina em CDs, no reator de leito fluidizado com a CGTase imobilizada foi da ordem de 17%, com um tempo de residência de aproximadamente 13 minutos. A produção de β-CD foi aproximadamente 4 vezes superior à de β-CD, comprovando que esta enzima trata-se de uma β-CGTase. A produção máxima de foi igual a 11 mM, representando 80% do total de CDs produzidas. Com um tempo de residência de aproximadamente 4 minutos, a produção de CDs (β-CD e у-CD) ficou em torno de 15% (10,4 mM de β-CD e 2,3 mM de β-CD). Com a utilização da CGTase livre, o tempo para se obter praticamente a mesma produção de CDs ( 10,0 mM de β-CD e 2,5 mM de β-CD superioridade do leito fluidizado com enzima imobilizada para produzir ciclodextrinas. Abstract: Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides, formed by a variable number of glucose units, linked to each other by α - 1,4-linkages. The most common are constituted by 6, 7 and 8 glucose units and are denominated α-CD, β-CD and у-CD, respectively. They are produced by the action of the enzyme Cyclodextrin Glycosyltransferase (CGTase) on the starch previously liquefied. Owing to the fact that CDs have an apolar cavity, which favors the encapsulation of a great variety of organic molecules, they have countless applications in the pharmaceutical, food and cosmetics industries, among others. In this work, the main objective was to study the production of CDs in a fluidized bed reactor, as a function of the residence time of the substrate in the bed of particles. CGTase was immobilized into controlled-pore silica (CPS) particles having a mean diameter of the order of 0.42 mm. CGTase originally from Bacillus alkalophilic sp., and cloned in Escherichia coli, was supplied by WACKER, with 193.1 mg of protein/g of liofilized enzyme and specific activity of 63.1 μmols of β-CD/(min.mg of protein), determined at 50°C and pH 8. The enzyme was purified by biospecific affinity chromatography, using Sepharose 6B as support and β-CD as the immobilized ligand. Afterwards, CGTase was immobilized into CPS by covalent bonding, using the silane-glutaraldehyde method. The purification showed a purification factor of 1.2 with an activity recovery of 72%. From the total protein submitted to purification, 94% was recovered, and 65.3% of this total corresponded to the enzyme CGTase. An enzymatic solution with 1.64 mg of protein/mL of solution was obtained with a specific activity of 73.80 μmols of β-CD/(min.mg of protein ). In the immobilization of CGTase, the yield of protein fixation was 28.96 %, producing an immobilized enzyme with 4.66 mg of protein/g of dry support and an activity of 8.62 μmols of β-CD/(min. gEI), which corresponds to an activity yield of 2,53%. The recovery of the total activity offered to immobilization was 28.68%. The production of CDs was made at 50°C, varying the immobilized enzyme load inside the reactor and fixing the porosity of the liquid-solid fluidized bed at 0.5. The substrate used was a solution of dextrin 10 (FLUKA) 100 g/L, with tris-HCl buffer, pH 8, 0.01 M and calcium chloride 5 mM. Samples were collected at the effluent of the reactor and the concentrations of β-CD and у-CD were determined by colorimetric methods using the dyes phenolphthalein and Bromocresol green, respectively. The maximum conversion of the dextrin to CDs, in the fluidized bed reactor, with immobilized CGTase, was about 17%, in which case the residence time was approximately 13 minutes. The production of β-CD was approximately four times superior to that of β-CD, showing that this enzyme is a у-CGTase. The maximum production of β-CD was 11 mM, representing 80% of the total CD produced. With a residence time of approximately 4 minutes, the production of CDs (β-CD and у-CD) was around 15% (10.4 mM of β-CD and 2.3 mM of у-CD). Using a free CGTase, the time necessary to obtain practically the same production of CDs (10.0 mM of β-CD and 2.5 mM of у-CD) is normally 24 hours. This result demontrates the superior quality of the fluidized bed reactor with immobilized enzyme to produce cyclodextrins.

β-CD

Idioma: Português Data de Publicação: 1998 Local de Publicação: Maringá, PR Orientador: Prof. Flávio Faria de Moraes Instituição: Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Engenharia Química Nível: Dissertação (mestrado em Engenharia Química)/ UEM: Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

Responsavel: beth
Categoria: Aplicação
Formato: Documento PDF
Arquivo: PauloWT.pdf
Tamanho: 1500 Kb (1536474 bytes)
Criado: 06-08-2013 18:05
Atualizado: 06-08-2013 18:47
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