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Consultar: Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

Título [PT]: Obtenção de extratos e frações de folhas de uma nova variedade de stevia rebaudiana, forticação da atividade antioxidante e antidiabética de whey protein isolado com fração de stevia rica em compostos fenólicos
Autor(es): Paula Gimenez Milani Fernandes
Palavras-chave [PT]:

Whey protein isolate. Stevia rebaudiana. Fração antioxidante. Compostos fenólicos. Flavonoides. Diabetes mellitus. Suplementação. Tratamento alternativo. Isolado protéico de soro. Fração antioxidante de stevia rebaudiana. Brasil.

whey protein isolate. Antioxidant fraction of Stevia rebaudiana. Phenolic compounds. Flavonoids. Diabetes mellitus. Brazil.

Silvio Cláudio da Costa [Orientador] - UEM Jurandir Fernando Comar Maria Ida Bonini Ravanelli Speziali José Domingos Fontana Antonio Roberto Giriboni Monteiro

Resumo: Stevia rebaudiana (Bert.). Bertoni é mundialmente conhecida e explorada por apresentar naturalmente em suas folhas, glicosídeos de esteviol de alto poder edulcorante. Entre estes compostos, os mais proeminentes são o esteviosídeo e o rebaudiosídeo A, ambos estudados nas últimas décadas também por suas propriedades antidiabéticas. Entretanto, além dos glicosídeos de esteviol, as folhas de estévia foram descritas como fonte de compostos fenólicos e flavonoides. Muitos esforços têm sido feitos para isolar e caracterizar frações ricas em compostos fenólicos de folhas de estévia, de uma nova variedade seminal e de elite, Stevia UEM-13, com o objetivo de avaliar seu potencial de uso como fonte multifuncional de compostos fenólicos. Este estudo relaciona a obtenção de uma fração de Stevia com alto conteúdo de compostos fenólicos, que teve sua composição centesimal determinada e também, seus principais fenólicos e flavonoides presentes foram identificados, por meio da análise LCMS. A fração com potencial para alimentos fortificantes foi adicionada em um isolado proteico obtido a partir de soro de leite (WPI), e o suplemento desenvolvido foi testado quanto aos seus efeitos antioxidantes e antidiabéticos. O objetivo deste estudo foi determinar a composição e o potencial antioxidante de folhas de uma nova seminal variedade de Stevia rebaudiana (Stevia UEM-13), determinar os teores de glicosídeos de esteviol, compostos fenólicos, flavonoides e de capacidade antioxidantes de diferentes extratos e frações obtidos a partir das folhas de Stevia UEM-13; e avaliar o potencial da fração com alta capacidade antioxidante, obtida pelo fracionamento em acetato de etila, como fortificadora ou enriquecedora da atividade antioxidante e antidiabética de isolado proteico do soro do leite (Whey protein) produzido por processos de separação por membranas. As plantas de Stevia rebaudiana da variedade seminal UEM 13 cultivadas em NEPRON (UEM) foram coletadas no de estágio máximo crescimento vegetativo. Estes arbustos foram previamente secos em estufa a 60°C e as folhas foram subsequentemente separadas dos caules e ramos, colocadas em sacos de polietileno e armazenadas a -18°C antes do desenvolvimento dos diferentes extratos. Os reagentes químicos foram adquiridos a Sigma-Aldrich. Diferentes extratos e frações foram obtidos a partir dessas folhas e foram analisados quanto aos teores de glicosídeos totais (CLAE), compostos fenólicos (Folin), flavonoides totais e capacidade antioxidante (DPPH). O Extrato aquoso das folhas de Stevia UEM 13 foi obtido por meio de uma extração aquosa de uma amostra de 2,0 g de folhas, adicionadas de 250 ml de água destiladas e aquecidas a 100 ºC. Amostras das folhas dessa variedade foram ainda usadas para extrações com os solventes etanol absoluto e metanol, os quais foram utilizados para extração em aparelho Sohxlet e maceração (somente etanol absoluto). O extrato metanólico, por apresentar maior rendimento de extração dos compostos de interesse foi fracionado com hexano, clorofórmio, acetato de etila e isobutanol e as frações obtidas foram analisadas. A fração de acetato de etila (ASF), por apresentar-se livre de glicosídeos e com alta capacidade antioxidante foi analisada em LCMS/MS, os compostos fenólicos e flavonoides foram identificados, e além disso sua composição proximal foi determinada. ASF foi usada como fração fortificadora de um isolado proteico do soro do leite (ASF foi adicionada ao WPI na concentração de 0,2%). A obtenção de WPI foi feita de acordo com Milani et al. (2016) com modificações. O soro foi concentrado em sistema de ultrafiltração (UF), diafiltração (DF) e (NF). Uma amostra deste concentrado foi seca em secador por pulverização. Os processos UF e DF foram feitos em um sistema com membranas filtrantes de polietersulfona (corte de 10 kD), marca Koch, em configuração espiral, com área de 50 cm2. Foram realizados 12 ciclos de diafiltração. A nanofiltração foi realizada em sistema de osmose reversa, composta por duas membranas de poliamida com massa molecular de corte 180D (Koch) e 500D (Millipore), ambas em configuração espiral, com área de 50 cm2 cada. A secagem do WPI foi realizada em atomizador secador spray. Um teste de citotoxicidade também foi realizado (teste MTT). Para testar a atividade antidiabética foram estabelecidos 4 grupos experimentais que receberam os seguintes suplementos diariamente: 1) WPI - isolado de proteína de soro de leite (100 mg/kg); 2) ASF - fração de estévia (0,2 mg/kg); 3) WPI + ASF - proteína isolada de soro de leite fortificada com 0,2% da fração de estévia (100 mg/ kg); 4) DC- diabético controle; recebeu apenas água e ração. Um quinto grupo controle (C), não diabético e não suplementado também foi estabelecido. A suplementação oral foi realizada diariamente, às 08:00 horas, por um período de 30 dias, por gavagem esofágica. Semanalmente foram avaliados glicemia de jejum e no estado alimentado, e peso corporal. Após os tratamentos foram avaliadas as taxas plasmáticas e séricas de glicose, colesterol total, colesterol HDL, triglicérides, frutosamina, AST e ALT. A capacidade antioxidante total também foi avaliada no plasma de todos os grupos de animais após o tratamento. Entre os principais resultados das diferentes extrações realizadas a partir das folhas de Stevia UEM-13, podemos destacar que o extrato metanólico apresentou maior rendimento de extração dos compostos de interesse quando comparado ao extrato etanólico e por isso foi fracionado com diferentes solventes. A fração isobotanólica mostrou maior teor de glicosídeos (65,3%). A fração obtida em acetato de etila apresentou o maior conteúdo de compostos fenólicos e flavonoides (524.20 mg equivalente de ácido gálico/g; 380.62 μg equivalente de quercetina/g, respectivamente), e também alta capacidade antioxidante e apresentou-se com baixo teor de glicosídeos. Os principais compostos identificados por LCMS/MS foram o ácido cafeico, quercetina-3-o-glicosídeo, cianidina-3- glicosídeo, kaempferol, quercetina, apigenina, ácido rozmarínico, ácido cloriogênico e ácido dicafeoilquínico. A fração de estevia em acetato de etila (ASF) foi utilizada como fonte multifuncional de compostos fenólicos na fortificação do isolado de proteínas de soro de leite (WPI) obtido por processos de separação de membranas. WPI fortificado com 0,2% de ASF teve sua atividade antioxidante aumentada em 80%. O WPI fortificado com ASF apresentou efeitos antidiabéticos mais pronunciados em relação ao WPI não fortificado, principalmente no controle glicêmico de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina. Importantes efeitos antioxidantes in vitro e in vivo foram mostrados pela fração de Stevia ASF, o que contribuiu de forma expressiva para fortificar o WPI. Este estudo pioneiro mostra que a ASF pode ser usada para enriquecer as propriedades antioxidantes e antidiabéticas do WPI. A avaliação da extração e do fracionamento desta planta utilizando diferentes solventes e metodologias, resultou em extratos de diferentes capacidades antioxidantes, que podem ser utilizados para enriquecer a literatura e contribuir para sua aplicação em alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos. Uma dieta rica em antioxidantes pode contribuir significativamente para prevenir doenças degenerativas, doenças cardiovasculares e metabólicas, como o diabetes mellitus. Assim, os alimentos naturais e industrializados enriquecidos com flavonoides e compostos fenólicos contribuem para a redução dessas doenças. O presente estudo mostrou que os extratos de etanol, metanol e acetato de etilo de folhas de Stevia rebaudiana (Stevia UEM-13) possuem um grande potencial antioxidante e podem ser usados como possíveis aditivos para melhorar a funcionalidade de alimentos e bebidas. Por meio dos processos de separação das membranas, foi possível obter a partir do soro do leite, um isolado (WPI) com uma concentração importante de proteínas. A fração Stevia, ASF, obtida com 3,82% de rendimento, exibiu compostos fenólicos como principais constituintes. Os principais ácidos fenólicos e flavonoides identificados na ASF estão de acordo com a literatura. A ASF na concentração de 0,2% promoveu aumento de 80% na atividade antioxidante WPI. Os testes fisiológicos mostraram que os três suplementos (ASF, WPI e WPI + ASF) foram benéficos para melhorar o controle metabólico de ratos diabéticos. O WPI fortificado com ASF foi o suplemento alimentar com maior funcionalidade, mostrando que a ASF tem potencial para ser utilizada como fortificador da atividade antioxidante e antidiabética de alimentos como o WPI, e possivelmente enriquecendo outros alimentos ou suplementos. Abstract: Stevia rebaudiana (Bert.). Bertoni is worldwide known and explored by presenting high sweetener power steviol glycosides naturally in its leaves. Among these compounds, the most prominent ones are the stevioside and the rebaudioside A, both have been studied in the last decades also by their antidiabetic properties. However, besides the steviol glycosides, the stevia leaves have been described as phenolic and flavonoids compounds source, with antioxidant and antidiabetic source. Many efforts have been made directed to isolating and characterizing fractions rich in phenolic compounds from stevia leaves of a new seminal and elite variety, Stevia UEM-13, with the purpose of evaluating their potential of use as multi-functional source of phenolic compounds. This study relates the obtainment of a stevia fraction with high phenolic compounds content, which had its centesimal composition determined and also, its main present phenolic and flavonoids were identified, through LCMS analysis. The fraction with potential for fortifying foods was added in a protein isolate obtained from whey (WPI), and the developed supplement was tested for its antioxidant potential and antidiabetic effects.The objective of this study was to determine the composition and antioxidant potential of leaves of a new seminal variety of Stevia rebaudiana (Stevia UEM-13), to determine the levels of steviol glycosides, phenolic compounds, flavonoids and antioxidant capacity of different extracts and fractions obtained from the leaves of Stevia UEM-13 and to evaluate the potential of the fraction with high antioxidant capacity, obtained by fractionation with ethyl acetate, as a fortifier of the antioxidant and antidiabetic activity of whey protein isolate produced by membrane separation processes.The plants of Stevia rebaudiana of the seminal variety UEM 13 grown at NEPRON (UEM) were collected at maximum vegetative growth stage. These shrubs were previously dried in an oven at 60°C and the leaves were subsequently separated from the stems and branches, placed in polyethylene bags, and stored at -18°C before developing different extracts. The chemical reagents were purchased from Sigma-Aldrich. Different extracts and fractions were obtained from these leaves and were analyzed for total glycosides (HPLC), phenolic compounds (Folin) and total flavonoids and antioxidant capacity (DPPH). Aqueous extract of Stevia leaves UEM-13 was obtained by means of an aqueous extraction of a sample of 2.0 g of leaves, added with 250 ml of distilled water and heated to 100 ºC. Samples from the same sheet were also used for extractions with the solvents absolute ethanol and methanol, which were used for extraction in Sohxlet apparatus and maceration (absolute ethanol only). The methanolic extract, due to the higher extraction yield of the compounds of interest, was fractionated with hexane, chloroform, ethyl acetate and isobutanol and the fractions obtained were analyzed. The ethyl acetate fraction (ASF), because it was free of glycosides and with high antioxidant capacity, was analyzed in LCMS/MS and the phenolic and flavonoid compounds were identified, and in addition its proximal composition was determined. ASF was used as a fortifying fraction of a whey protein isolate (ASF was added at 0.2% concentration to the WPI). The WPI obtaining was made in accordance to Milani et al. (2016) with modifications. The whey was concentrated in ultrafiltration system (UF), diafiltration (DF) and (NF). A sample of this concentrated was dried in spray dryer. The UF and DF processes were made in a system with polyethersulfone filtering membranes (10 kD cut off), Koch brand, in spiral configuration, with 50 cm2 area. 12 diafiltration cycles were performed. The nanofiltration was performed in reverse osmosis system, composed by two polyamide membranes with 180D cut off molecular mass (Koch) and 500D (Millipore), both in spiral configuration, with 50 cm2 area each one. The WPI drying was made in a spray dryer atomizer. The MTT test was made in adipose cells to evaluate the ASF fraction cytotoxicity. To test the antidiabetic activity, 4 experimental groups were established, receiving the following supplements daily: 1) WPI - whey protein isolate (100 mg/kg); 2) ASF - stevia fraction (0.2 mg/kg); 3) WPI+ASF - protein isolate of whey fortified with 0.2% of the stevia fraction (100mg/kg); 4) DC- diabetic control; Received only water and feed. A fifth group (C) non-diabetic and non-supplemented was also established. The oral supplementation was performed daily, at 08:00 AM, for a 30 days period, by gavage (the control diabetic animals group received pure water). Fasting and fed blood glucose and body weight were evaluated weekly. After the treatments were evaluated plasma and serum levels of glucose, total cholesterol, HDL cholesterol, triglycerides, fructosamine, AST and ALT. The total antioxidant capacity was also evaluated in the plasma of all groups of animals after treatment. Among the main results of the different extractions made from the Stevia UEM-13 leaves, we can highlight that the methanolic extract presented higher extraction yield of the compounds of interest when compared to the ethanolic extract and therefore it was fractionated with different solvents. The isobotanolic fraction showed a higher content of glycosides (65.3%). The fraction obtained in ethyl acetate presented the highest content of phenolic compounds and flavonoids (524.20 mg galic acid equivalent/g; 380.62 μg quercetin equivalent/g respectively), and also of antioxidant capacity and presented with low glycosides content. the main identified by LC-MS were caffeic acid, quercetin-3-o-glycoside, cyanidin-3-glucoside, kaempferol, quercetin, apigenin, rozmarinic acid, clhologenic acid e dicaffeoylquinic acid. The stevia fraction in ethyl acetate (ASF) was used as a multi-functional source of phenolic compounds in the fortification of the whey protein isolate (WPI) obtained by membranes separation processes. WPI fortified with 0.2% of ASF had its antioxidant activity increased in 80%. WPI fortified with ASF presented more pronounced antidiabetic effects in relation to the WPI unfortified, mainly in the glycemic control of diabetic animals induced by streptozotocin. In vitro and in vivo antioxidant effects found important in stevia fraction, what contributed in an expressive way for fortifying the WPI. This pioneer study shows that the ASF can be used for enriching the WPI antioxidant and antidiabetic properties. The evaluation of extraction and fractionation of this plant using different solvents and methodologies resulted in extracts of different antioxidant capacity, which can be used to enrich the literature and contribute to their application in foods, pharmaceuticals and cosmetics. A diet rich in antioxidants may contribute significantly to prevent degenerative diseases, cardiovascular and metabolic diseases, such as diabetes mellitus. Thus, natural and industrialized foods enriched with flavonoids and phenolic compounds contribute to the reduction of these diseases. The present study showed that ethanol, methanol and ethyl acetate extracts of Stevia rebaudiana leaves (Stevia UEM-13) have a great potential antioxidant and so can be used as possible additives to enhance the functionality of food and beverages. Through membranes separation processes it was possible to obtain from whey the whey proteins isolate (WPI), which had its centesimal composition determined; The stevia fraction, obtained from Stevia UEM 13 variety leaves, with 3.82% yield, exhibited phenolic compounds as main constituents. The main identified phenolic acids and flavonoids in the ASF comply with the data literature. The ASF in the 0.2% concentration promoted increase of 80% in the WPI antioxidant activity. The physiological tests showed that the three supplements (ASF, WPI and WPI+ASF) were beneficial for improving the metabolic control of diabetic mice. The WPI fortified with ASF was the food supplement with expressive functionality, showing that the ASF has potential to be used as a fortifier or an antioxidant and antidiabetic activity enriching of foods or supplements.

Idioma: Inglês Data de Publicação: 2017 Local de Publicação: Maringá, PR Orientador: Prof. Dr. Silvio Cláudio da Costa Instituição: Universidade Estadual de Maringá . Centro de Ciências Agrárias Nível: Dissertação (mestrado em Ciência de Alimentos) UEM: Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

Responsavel: edson
Categoria: Aplicação
Formato: Documento PDF
Arquivo: TESE.pdf
Tamanho: 1801 Kb (1843902 bytes)
Criado: 07-06-2017 14:38
Atualizado: 07-06-2017 14:52
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