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Consultar: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Incio > Dissertaes e Teses > Cincias Agrrias > Cincia e Tecnologia de Alimentos > Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Ttulo [PT]: Aplicaes biotecnolgicas e nutracuticas de Pleurotus spp
Autor(es): Rbia Carvalho Gomes Corra
Palavras-chave [PT]:

Formulaes bioativas. Potencial anti-inflamatrio. Composio qumica. Pr-tratamento biolgico. Enzimas. Perxido de hidrognio. Sacarificao. Pleurotus spp. Pleurotus ostreatoroseus. Caracterizao qumica. Bioatividade. Pleurotus pulmonarius. Spent mushroom substrate (SMS). Produo de etanol celulsico. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Pleurotus ostreatoroseus. Bioactive formulations. Anti-inflammatory potential. Chemical composition. Biological pretreatment. Enzymes. Hydrogen peroxide. Pleurotus pulmonarius. Saccharification. Spent mushroom substrate. Brazil.
Titulao: Doutor em Cincia de Alimentos
Banca:
Rosane Marina Peralta [Orientador] - UEM
Charles Windson Isidoro Haminiuk
Nilson Evelazio de Souza
Anglica Marquetotti Salcedo Vieira
Fabola Dorneles Incio
Resumo:
Resumo: O gnero Pleurotus um grupo cosmopolita de cogumelos que apresenta alto valor nutritivo e propriedades teraputicas, alm de uma ampla gama de aplicaes biotecnolgicas e ambientais. As mais importantes espcies de Pleurotus cultivadas em grande escala so P. ostreatus e P. pulmonarius. No entanto, a deteco de novos bioativos em espcies Pleurotus menos exploradas, em conjunto com a determinao de suas estruturas qumicas e mecanismos de ao, so demandas que a cincia est buscando realizar. P. ostreatoroseus um exemplo de cogumelo comestvel brasileiro cuja caracterizao qumica e bioatividade permanecem pouco explorados. Alm disso, outra atual e importante questo o fato de que as indstrias de cogumelos geram um excesso de oferta no utilizada de fibras lignocelulsicas pr-tratadas, chamado de Spent Mushroom Substrate (SMS). Esta biomassa lignocelulsica pr-tratada pode ser utilizado para produzir etanol, uma promissora fonte de energia alternativa ao petrleo bruto que prejudicial ao meio ambiente. O custo de produo de etanol a partir de materiais lignocelulsicos baseado em tecnologias atuais relativamente elevado, e os principais desafios so o baixo rendimento e o alto custo do processo de hidrlise. Portanto, os principais objetivos dos trs artigos que compem esta tese foram: 1) Produzir uma anlise crtica sobre os aspectos relacionados aos compostos qumicos isolados do gnero Pleurotus com possveis aplicaes biotecnolgicas, nutricionais e teraputicas. Na reviso, apenas artigos publicados aps 2005 foram considerados. 2) Preparar formulaes bioativas formulaes bioativas do corpo de frutificao e miclio de P. ostreatusroseus (extratos etanlicos), para caracteriz-los em termos de compostos hidroflicos e lipoflicos, para avaliar suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatria e potencial antimicrobiano, e para confirmar a sua no toxicidade numa cultura celular primria de clulas de fgado de porco. 3) Investigar o potencial do SMS de P. pulmonarius na gerao de acares redutores fermentveis, atravs da sacarificao de seus polissacardeos por uma mistura de celulase e β-glucosidase comerciais. As formulaes bioativas de P. ostreatoroseus foram obtidas atravs da extrao de seu miclio (produzido por cultivo submerso) e basidioma com uma soluo etanlica (70:30 em gua). Os materiais solveis foram primeiramente concentrados em um rotavapor a vcuo a 40 C, e liofilizados. Os acares livres foram determinados por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) acoplada a um detector de ndice de refraco (detector RI). Os cidos orgnicos foram determinados por cromatografia lquida de ultra eficincia (UPLC) acoplada a um detector de arranjo de fotodiodos (PDA). A determinao dos cidos fenlicos foi realizada utilizando UPLC. Uma linha de deteco dupla foi realizada no DAD com a adoo de 280 nm como o comprimento de onda preferido e num espectrmetro de massas (MS) ligado a um sistema de HPLC atravs da sada de clulas DAD. Os tocoferis foram determinados por HPLC acoplado a um detector de fluorescncia. Com relao aos ensaios de atividade antioxidante, as concentraes da amostra (mg.mL-1) proporcionando 50% de atividade antioxidante ou 0,5 de absorbncia (EC50) foram calculados a partir dos grficos de percentagens de atividade antioxidante (DPPH, β-caroteno / linoleato e TBARS) ou ensaios de absorbncia a 690 nm (ensaio do azul ferricianeto / prussiano) contra as concentraes das amostras. Trolox foi usado como controle positivo. Para o ensaio de atividade anti-inflamatria, as formulaes bioativas foram submetidas a diluies de 8 mg.mL-1 a 0,125 mg.mL-1 e os testes foram realizados com a linha celular RAW264.7 de macrfagos de rato. O efeito das amostras no crescimento das clulas primrias de fgado de suno (PLP2), segundo metodologia estabelecida pelo grupo, foi avaliada por ensaio colorimtrico com sulforrodamina B (SRB). Para o ensaio de atividade antibacteriana, foram utilizadas bactrias Gram-positivas e Gram-negativas. As bactrias Gram-negativas foram: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter cloacae; as Gram-positivas foram: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, e Listeria monocytogenes. As concentraes inibitria mnima (MIC) e bactericida mnima (MBC) foram determinadas pelo mtodo de microdiluio. Para os bioensaios antifngicos, foram usados os seguintes microfungos: Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, e Penicillium verrucosum var. cyclopium. A determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) foi realizada por uma tcnica de diluio em srie usando placas de microtitulao de 96 poos. 2) P. pulmonarius foi cultivado em cultura em estado slido com sabugo de milho. Durante 30 dias de crescimento vegetativo, em intervalos de 5 dias, amostras de SMS foram coletados a partir dos sacos de cultivo e analisados a fim de investigar as transformaes ocorridas at a formao dos corpos de frutificao. As avaliaes do crescimento micelial, consumo de acares redutores e determinaes de atividades enzimticas (lacase, catalase, peroxidase e Mn superxido dismutase, SOD) foram realizadas em extratos brutos aquosos obtidos a partir de cada amostra. O teor de perxido de hidrognio foi quantificado atravs do ensaio de 2'-7'-diclorofluorescena-diacetato (DCFH-DA). As fibras do sabugo de milho obtidas antes e aps o cultivo do fungo foram sujeitas a hidrlise enzimtica utilizando celulase de Trichoderma reesei ATCC e β-glucosidase de Aspergillus niger. Uma unidade de atividade enzimtica foi definida como a quantidade de enzima capaz de libertar 1 nmol de produto por minuto. Alm disso, a caracterizao do sabugo de milho antes e depois do cultivo de P. pulmonarius foi realizada por microscopia eletrnica de varredura e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. A influncia do crescimento de P. pulmonarius sobre o substrato foi analisada em termos das diminuies percentuais na intensidade dos picos de lignina (1427 e 1515 cm-1) e de hidratos de carbono (1395, 1098 e 898 cm-1). As formulaes bioativas contm pelo menos cinco acares livres, quatro cidos orgnicos, quatro compostos fenlicos e dois tocoferis. A formulao a base de basidioma revelou maior poder redutor, maior atividade de eliminao do DPPH, maior inibio da peroxidao em sistema β-caroteno e maior inibio da peroxidao lipdica em homogenatos de crebro, quando comparada preparao a base de miclio, bem como superiores atividades anti-inflamatria e antimicrobiana. A ausncia de hepatotoxicidade foi confirmada em clulas primrias de fgado suno. Essas respostas funcionais podem ser relacionadas com os nveis de componentes bioativos, incluindo os cidos fenlicos, cidos orgnicos e os tocoferis. Aps a colheita dos cogumelos, o SMS foi hidrolisado com celulase e β- glicosidase comerciais, resultando em 300 g de acares redutores / kg de SMS seco, sendo mais de 60% de glicose. Nossos dados sugerem que o SMS obtido a partir de P. pulmonarius cultivado em espiga de milho uma fibra lignocelulsica pr-tratada promissora para a obteno de etanol celulsico. Uma srie de compostos j foram precisamento definidos em Pleurotus spp., incluindo polissacardeos, fenlicos, terpenos e esterides. No entanto, a intensificao da determinao da estrutura altamente desejvel e exige esforos considerveis. Outros estudos, incluindo ensaios clnicos, devem ser realizados para verificar a segurana destes compostos como alternativas adequadas s drogas convencionais. No menos importante estender a busca de novos bioativos para espcie Pleurotus menos explorados. Considerando todo o contexto, e at onde temos conhecimento, este foi o primeiro relato de propriedades anti-inflamatrias de extratos dos corpos de frutificao e miclio de P. ostreaturoseus e, a partir dos resultados obtidos, um claro potencial anti-inflamatrio e antimicrobiano das amostras testadas pode ser inferido. Por isso, estas formulaes podem ser usadas para o preparo de suplementos dietticos para fins nutracuticos. Este estudo revela o potencial do SMS obtido a partir do cultivo de P. pulmonarius como uma fonte de fibras lignocelulsicas pr-tratadas biologicamente, teis para a obteno de etanol celulsico. Hoje em dia, o custo de produo de etanol de celulose relativamente alto. O uso de SMS pode ser uma estratgia para melhorar o rendimento e reduzir os custos do processo.

Abstract: The genus Pleurotus is a cosmopolitan group of mushrooms with high nutritional value and therapeutic properties, besides a wide array of biotechnological and environmental applications. The most important Pleurotus species cultivated in large scale are P. ostreatus and P. pulmonarius. However, the detection of novel bioactives in less explored Pleurotus species, together with the determination of their chemical structures and mechanisms of action, are demands that science is seeking to accomplish. P. ostreatoroseus is an example of a Brazilian edible mushroom whose chemical characterization and bioactivity remain underexplored. Besides, another current and important issue is the fact that mushroom processing industries generate an unused surplus of pretreated lignocellulosic fibers called spent mushroom substrate (SMS). This pretreated lignocellulosic biomass can be used to produce ethanol, a promising alternative energy source for the environmentally unfriendly crude oil. The cost of ethanol production from lignocellulosic materials is relatively high based on current technologies, and the main challenges are the low yield and high cost of the hydrolysis process. Therefore, the principal aims of the three articles that comprise this thesis were: 1) To provide a critical review on aspects related to chemical compounds isolated from the genus Pleurotus with possible biotechnological, nutritional and therapeutic uses. In the review, only reports published after 2005 were considered. 2) To prepare bioactive formulations of the fruiting body and mycelium of P. ostreatusroseus (ethanolic extracts), to characterize them in terms of hydrophylic and lipophilic compounds, to evaluate their antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial potential, and to confirm their non-toxicity in a primary cell culture of porcine liver cells. 3) To investigate the potential of SMS of P. pulmonarius in the generation of fermentable reducing sugars through saccharification of its polysaccharides by a mixture of commercial cellulase and β-glucosidase. The bioactive formulations of P. ostreatoroseus were obtained by extracting its mycelium (produced by submerged culture) and basidioma with an ethanolic (70:30 in water) solution. The soluble materials were firstly concentrated with a rotary vacuum evaporator at 40 C, and freeze-dried. Free sugars were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a refraction index detector (RI detector). Organic acids were determined by ultra-fast liquid chromatography (UFLC) coupled with a photodiode array detector (PDA). Phenolic acids determination was performed using UFLC. Double online detection was carried out in the DAD using 280 nm as the preferred wavelength and in a mass spectrometer (MS) connected to a HPLC system via the DAD cell outlet. Tocopherols were determined by HPLC coupled to a fluorescence detector. Regarding the antioxidant activity assays, the sample concentrations (mgmL−1) providing 50% antioxidant activity or 0.5 absorbance (EC50) were calculated from the graphs of antioxidant activity percentages (DPPH, β-carotene/linoleate and TBARS assays) or absorbance at 690 nm (ferricyanide/Prussian blue assay) against the sample concentrations. Trolox was used as a positive control. For the anti-inflammatory activity assay, the bioactive formulations were subjected to further dilutions from 8 mgmL−1 to 0.125 mgmL−1 and the tests were performed in mouse macrophage-like cell line RAW264.7. The effect of the samples on the growth of porcine liver primary cells (PLP2), according to methodology established by the group, was evaluated by the sulforhodamine B (SRB) colorimetric assay. For the antibacterial activity assay, |Gram-negative and Gram positive bacteria were used. The Gram-negative bacteria were: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter cloacae; the Gram-positive were: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, and Listeria monocytogenes. The minimal inhibitory (MIC) and minimal bactericidal (MBC) concentrations were determined by the microdilution method. For the antifungal bioassays, the following microfungi were used: Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, and Penicillium verrucosum var. cyclopium. The minimal inhibitory concentration (MIC) determination was performed by a serial dilution technique using 96-well microtitre plates. P. pulmonarius was cultivated on corn cob solid state cultures. During 30 days of vegetative growth, at intervals of 5 days, samples of SMS were collected from the cultivation bags and analyzed in order to investigate the transformations that occurred until fruiting bodies formation. Evaluations of the mycelial growth and consumption of reducing sugars and determinations of enzyme activities (laccase, catalase, Mn peroxidase and superoxide dismutase, SOD) were done in the crude water extracts obtained from each sample. The hydrogen peroxide content was quantified via the 2′7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) assay. The corn cob fibers obtained before and after fungal cultivation were subjected to enzymatic hydrolysis using cellulase from Trichoderma reesei ATCC and β- glucosidase from Aspergillus niger. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of product per minute. Also, the characterization of corn cob before and after P. pulmonarius cultivation was performed by scanning electron microscopy and Fourier transform infrared spectroscopy. The influence of the growth of P. pulmonarius on the substrate was analyzed in terms of the percent diminutions in intensity of the lignin (1427 and 1515 cm-1) and carbohydrate peaks (1395, 1098 and 898 cm-1). The bioactive formulations contain at least five free sugars, four organic acids, four phenolic compounds and two tocopherols. The fruiting body-based formulation revealed higher reducing power, DPPH scavenging activity, β-carotene bleaching inhibition and lipid peroxidation inhibition in brain homogenates than the mycelium-based preparation, as well as higher anti-inflammatory and antimicrobial activities. The absence of hepatotoxicity was confirmed in porcine liver primary cells. These functional responses can be related to the levels of bioactive components including phenolic acids, organic acids and tocopherols. After mushroom harvesting, the SMS was hydrolyzed with commercial cellulase and β-glucosidase resulting in 300 g reducing sugars/kg dry SMS, being more than 60% glucose. Our data suggest that the SMS obtained from P. pulmonarius cultured on corn cob is a promising pretreated lignocellulose fiber for the obtainment of cellulosic ethanol. A series of compounds have already been precisely defined in Pleurotus spp., including polysaccharides, phenolics, terpenes and sterols. However, intensification of structure determination is highly desirable and demands considerable efforts. Further studies including clinical trials need to be carried out to ascertain the safety of these compounds as adequate alternatives to conventional drugs. Not less important is to extend the search for novel bioactives to less explored Pleurotus species. Overall, and to the best of our knowledge, this was the first report of anti-inflammatory properties of P. ostreatoroseus fruiting body and mycelium extracts, and from the results obtained, a clear anti-inflammatory and antimicrobial potential of the tested samples can be inferred. Therefore, these formulations can be used to prepare dietary supplements for nutraceutical purposes. This study reveals the potential of the SMS from P. pulmonarius cultivation as a source of biologically pretreated lignocellulosic fibers, useful for the obtainment of cellulosic ethanol. Nowadays, the cost of production of cellulosic ethanol is relatively high. The use of SMS could be a strategy for improving the yield and reducing the costs of the process.
Data da defesa: 2016
Cdigo: vtls000225944
Informaes adicionais:
Idioma: Portugus
Data de Publicao: 2016
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Rosane Marina Peralta
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias Agrrias
Nvel: Tese (doutorado em Cincia de Alimentos)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: TESE RUBIA IMPRESSO.pdf
Tamanho: 1449 Kb (1483993 bytes)
Criado: 06-06-2017 17:31
Atualizado: 06-06-2017 17:43
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