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Consultar: Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

Título [PT]: Aplicações biotecnológicas e nutracêuticas de Pleurotus spp
Autor(es): Rúbia Carvalho Gomes Corrêa
Palavras-chave [PT]:

Formulações bioativas. Potencial anti-inflamatório. Composição química. Pré-tratamento biológico. Enzimas. Peróxido de hidrogênio. Sacarificação. Pleurotus spp. Pleurotus ostreatoroseus. Caracterização química. Bioatividade. Pleurotus pulmonarius. Spent mushroom substrate (SMS). Produção de etanol celulósico. Brasil.

Pleurotus ostreatoroseus. Bioactive formulations. Anti-inflammatory potential. Chemical composition. Biological pretreatment. Enzymes. Hydrogen peroxide. Pleurotus pulmonarius. Saccharification. Spent mushroom substrate. Brazil.

Rosane Marina Peralta [Orientador] - UEM Charles Windson Isidoro Haminiuk Nilson Evelazio de Souza Angélica Marquetotti Salcedo Vieira Fabíola Dorneles Inácio

Resumo: O gênero Pleurotus é um grupo cosmopolita de cogumelos que apresenta alto valor nutritivo e propriedades terapêuticas, além de uma ampla gama de aplicações biotecnológicas e ambientais. As mais importantes espécies de Pleurotus cultivadas em grande escala são P. ostreatus e P. pulmonarius. No entanto, a detecção de novos bioativos em espécies Pleurotus menos exploradas, em conjunto com a determinação de suas estruturas químicas e mecanismos de ação, são demandas que a ciência está buscando realizar. P. ostreatoroseus é um exemplo de cogumelo comestível brasileiro cuja caracterização química e bioatividade permanecem pouco explorados. Além disso, outra atual e importante questão é o fato de que as indústrias de cogumelos geram um excesso de oferta não utilizada de fibras lignocelulósicas pré-tratadas, chamado de “Spent Mushroom Substrate” (SMS). Esta biomassa lignocelulósica pré-tratada pode ser utilizado para produzir etanol, uma promissora fonte de energia alternativa ao petróleo bruto que é prejudicial ao meio ambiente. O custo de produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos baseado em tecnologias atuais é relativamente elevado, e os principais desafios são o baixo rendimento e o alto custo do processo de hidrólise. Portanto, os principais objetivos dos três artigos que compõem esta tese foram: 1) Produzir uma análise crítica sobre os aspectos relacionados aos compostos químicos isolados do gênero Pleurotus com possíveis aplicações biotecnológicas, nutricionais e terapêuticas. Na revisão, apenas artigos publicados após 2005 foram considerados. 2) Preparar formulações bioativas formulações bioativas do corpo de frutificação e micélio de P. ostreatusroseus (extratos etanólicos), para caracterizá-los em termos de compostos hidrofílicos e lipofílicos, para avaliar suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatória e potencial antimicrobiano, e para confirmar a sua não toxicidade numa cultura celular primária de células de fígado de porco. 3) Investigar o potencial do SMS de P. pulmonarius na geração de açúcares redutores fermentáveis, através da sacarificação de seus polissacarídeos por uma mistura de celulase e β-glucosidase comerciais. As formulações bioativas de P. ostreatoroseus foram obtidas através da extração de seu micélio (produzido por cultivo submerso) e basidioma com uma solução etanólica (70:30 em água). Os materiais solúveis foram primeiramente concentrados em um rotavapor a vácuo a 40 ° C, e liofilizados. Os açúcares livres foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a um detector de índice de refracção (detector RI). Os ácidos orgânicos foram determinados por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) acoplada a um detector de arranjo de fotodiodos (PDA). A determinação dos ácidos fenólicos foi realizada utilizando UPLC. Uma linha de detecção dupla foi realizada no DAD com a adoção de 280 nm como o comprimento de onda preferido e num espectrômetro de massas (MS) ligado a um sistema de HPLC através da saída de células DAD. Os tocoferóis foram determinados por HPLC acoplado a um detector de fluorescência. Com relação aos ensaios de atividade antioxidante, as concentrações da amostra (mg.mL-1) proporcionando 50% de atividade antioxidante ou 0,5 de absorbância (EC50) foram calculados a partir dos gráficos de percentagens de atividade antioxidante (DPPH, β-caroteno / linoleato e TBARS) ou ensaios de absorbância a 690 nm (ensaio do azul ferricianeto / prussiano) contra as concentrações das amostras. Trolox foi usado como controle positivo. Para o ensaio de atividade anti-inflamatória, as formulações bioativas foram submetidas a diluições de 8 mg.mL-1 a 0,125 mg.mL-1 e os testes foram realizados com a linha celular RAW264.7 de macrófagos de rato. O efeito das amostras no crescimento das células primárias de fígado de suíno (PLP2), segundo metodologia estabelecida pelo grupo, foi avaliada por ensaio colorimétrico com sulforrodamina B (SRB). Para o ensaio de atividade antibacteriana, foram utilizadas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As bactérias Gram-negativas foram: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter cloacae; as Gram-positivas foram: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, e Listeria monocytogenes. As concentrações inibitória mínima (MIC) e bactericida mínima (MBC) foram determinadas pelo método de microdiluição. Para os bioensaios antifúngicos, foram usados os seguintes microfungos: Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, e Penicillium verrucosum var. cyclopium. A determinação da concentração inibitória mínima (MIC) foi realizada por uma técnica de diluição em série usando placas de microtitulação de 96 poços. 2) P. pulmonarius foi cultivado em cultura em estado sólido com sabugo de milho. Durante 30 dias de crescimento vegetativo, em intervalos de 5 dias, amostras de SMS foram coletados a partir dos sacos de cultivo e analisados a fim de investigar as transformações ocorridas até a formação dos corpos de frutificação. As avaliações do crescimento micelial, consumo de açúcares redutores e determinações de atividades enzimáticas (lacase, catalase, peroxidase e Mn superóxido dismutase, SOD) foram realizadas em extratos brutos aquosos obtidos a partir de cada amostra. O teor de peróxido de hidrogénio foi quantificado através do ensaio de 2'-7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA). As fibras do sabugo de milho obtidas antes e após o cultivo do fungo foram sujeitas a hidrólise enzimática utilizando celulase de Trichoderma reesei ATCC e β-glucosidase de Aspergillus niger. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de libertar 1 nmol de produto por minuto. Além disso, a caracterização do sabugo de milho antes e depois do cultivo de P. pulmonarius foi realizada por microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. A influência do crescimento de P. pulmonarius sobre o substrato foi analisada em termos das diminuições percentuais na intensidade dos picos de lignina (1427 e 1515 cm-1) e de hidratos de carbono (1395, 1098 e 898 cm-1). As formulações bioativas contém pelo menos cinco açúcares livres, quatro ácidos orgânicos, quatro compostos fenólicos e dois tocoferóis. A formulação a base de basidioma revelou maior poder redutor, maior atividade de eliminação do DPPH, maior inibição da peroxidação em sistema β-caroteno e maior inibição da peroxidação lipídica em homogenatos de cérebro, quando comparada à preparação a base de micélio, bem como superiores atividades anti-inflamatória e antimicrobiana. A ausência de hepatotoxicidade foi confirmada em células primárias de fígado suíno. Essas respostas funcionais podem ser relacionadas com os níveis de componentes bioativos, incluindo os ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e os tocoferóis. Após a colheita dos cogumelos, o SMS foi hidrolisado com celulase e β- glicosidase comerciais, resultando em 300 g de açúcares redutores / kg de SMS seco, sendo mais de 60% de glicose. Nossos dados sugerem que o SMS obtido a partir de P. pulmonarius cultivado em espiga de milho é uma fibra lignocelulósica pré-tratada promissora para a obtenção de etanol celulósico. Uma série de compostos já foram precisamento definidos em Pleurotus spp., incluindo polissacarídeos, fenólicos, terpenos e esteróides. No entanto, a intensificação da determinação da estrutura é altamente desejável e exige esforços consideráveis. Outros estudos, incluindo ensaios clínicos, devem ser realizados para verificar a segurança destes compostos como alternativas adequadas às drogas convencionais. Não menos importante é estender a busca de novos bioativos para espécie Pleurotus menos explorados. Considerando todo o contexto, e até onde temos conhecimento, este foi o primeiro relato de propriedades anti-inflamatórias de extratos dos corpos de frutificação e micélio de P. ostreaturoseus e, a partir dos resultados obtidos, um claro potencial anti-inflamatório e antimicrobiano das amostras testadas pode ser inferido. Por isso, estas formulações podem ser usadas para o preparo de suplementos dietéticos para fins nutracêuticos. Este estudo revela o potencial do SMS obtido a partir do cultivo de P. pulmonarius como uma fonte de fibras lignocelulósicas pré-tratadas biologicamente, úteis para a obtenção de etanol celulósico. Hoje em dia, o custo de produção de etanol de celulose é relativamente alto. O uso de SMS pode ser uma estratégia para melhorar o rendimento e reduzir os custos do processo. Abstract: The genus Pleurotus is a cosmopolitan group of mushrooms with high nutritional value and therapeutic properties, besides a wide array of biotechnological and environmental applications. The most important Pleurotus species cultivated in large scale are P. ostreatus and P. pulmonarius. However, the detection of novel bioactives in less explored Pleurotus species, together with the determination of their chemical structures and mechanisms of action, are demands that science is seeking to accomplish. P. ostreatoroseus is an example of a Brazilian edible mushroom whose chemical characterization and bioactivity remain underexplored. Besides, another current and important issue is the fact that mushroom processing industries generate an unused surplus of pretreated lignocellulosic fibers called spent mushroom substrate (SMS). This pretreated lignocellulosic biomass can be used to produce ethanol, a promising alternative energy source for the environmentally unfriendly crude oil. The cost of ethanol production from lignocellulosic materials is relatively high based on current technologies, and the main challenges are the low yield and high cost of the hydrolysis process. Therefore, the principal aims of the three articles that comprise this thesis were: 1) To provide a critical review on aspects related to chemical compounds isolated from the genus Pleurotus with possible biotechnological, nutritional and therapeutic uses. In the review, only reports published after 2005 were considered. 2) To prepare bioactive formulations of the fruiting body and mycelium of P. ostreatusroseus (ethanolic extracts), to characterize them in terms of hydrophylic and lipophilic compounds, to evaluate their antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial potential, and to confirm their non-toxicity in a primary cell culture of porcine liver cells. 3) To investigate the potential of SMS of P. pulmonarius in the generation of fermentable reducing sugars through saccharification of its polysaccharides by a mixture of commercial cellulase and β-glucosidase. The bioactive formulations of P. ostreatoroseus were obtained by extracting its mycelium (produced by submerged culture) and basidioma with an ethanolic (70:30 in water) solution. The soluble materials were firstly concentrated with a rotary vacuum evaporator at 40 °C, and freeze-dried. Free sugars were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a refraction index detector (RI detector). Organic acids were determined by ultra-fast liquid chromatography (UFLC) coupled with a photodiode array detector (PDA). Phenolic acids determination was performed using UFLC. Double online detection was carried out in the DAD using 280 nm as the preferred wavelength and in a mass spectrometer (MS) connected to a HPLC system via the DAD cell outlet. Tocopherols were determined by HPLC coupled to a fluorescence detector. Regarding the antioxidant activity assays, the sample concentrations (mg·mL−1) providing 50% antioxidant activity or 0.5 absorbance (EC50) were calculated from the graphs of antioxidant activity percentages (DPPH, β-carotene/linoleate and TBARS assays) or absorbance at 690 nm (ferricyanide/Prussian blue assay) against the sample concentrations. Trolox was used as a positive control. For the anti-inflammatory activity assay, the bioactive formulations were subjected to further dilutions from 8 mg·mL−1 to 0.125 mg·mL−1 and the tests were performed in mouse macrophage-like cell line RAW264.7. The effect of the samples on the growth of porcine liver primary cells (PLP2), according to methodology established by the group, was evaluated by the sulforhodamine B (SRB) colorimetric assay. For the antibacterial activity assay, |Gram-negative and Gram positive bacteria were used. The Gram-negative bacteria were: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterobacter cloacae; the Gram-positive were: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, and Listeria monocytogenes. The minimal inhibitory (MIC) and minimal bactericidal (MBC) concentrations were determined by the microdilution method. For the antifungal bioassays, the following microfungi were used: Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, and Penicillium verrucosum var. cyclopium. The minimal inhibitory concentration (MIC) determination was performed by a serial dilution technique using 96-well microtitre plates. P. pulmonarius was cultivated on corn cob solid state cultures. During 30 days of vegetative growth, at intervals of 5 days, samples of SMS were collected from the cultivation bags and analyzed in order to investigate the transformations that occurred until fruiting bodies formation. Evaluations of the mycelial growth and consumption of reducing sugars and determinations of enzyme activities (laccase, catalase, Mn peroxidase and superoxide dismutase, SOD) were done in the crude water extracts obtained from each sample. The hydrogen peroxide content was quantified via the 2′–7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) assay. The corn cob fibers obtained before and after fungal cultivation were subjected to enzymatic hydrolysis using cellulase from Trichoderma reesei ATCC and β- glucosidase from Aspergillus niger. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of product per minute. Also, the characterization of corn cob before and after P. pulmonarius cultivation was performed by scanning electron microscopy and Fourier transform infrared spectroscopy. The influence of the growth of P. pulmonarius on the substrate was analyzed in terms of the percent diminutions in intensity of the lignin (1427 and 1515 cm-1) and carbohydrate peaks (1395, 1098 and 898 cm-1). The bioactive formulations contain at least five free sugars, four organic acids, four phenolic compounds and two tocopherols. The fruiting body-based formulation revealed higher reducing power, DPPH scavenging activity, β-carotene bleaching inhibition and lipid peroxidation inhibition in brain homogenates than the mycelium-based preparation, as well as higher anti-inflammatory and antimicrobial activities. The absence of hepatotoxicity was confirmed in porcine liver primary cells. These functional responses can be related to the levels of bioactive components including phenolic acids, organic acids and tocopherols. After mushroom harvesting, the SMS was hydrolyzed with commercial cellulase and β-glucosidase resulting in 300 g reducing sugars/kg dry SMS, being more than 60% glucose. Our data suggest that the SMS obtained from P. pulmonarius cultured on corn cob is a promising pretreated lignocellulose fiber for the obtainment of cellulosic ethanol. A series of compounds have already been precisely defined in Pleurotus spp., including polysaccharides, phenolics, terpenes and sterols. However, intensification of structure determination is highly desirable and demands considerable efforts. Further studies including clinical trials need to be carried out to ascertain the safety of these compounds as adequate alternatives to conventional drugs. Not less important is to extend the search for novel bioactives to less explored Pleurotus species. Overall, and to the best of our knowledge, this was the first report of anti-inflammatory properties of P. ostreatoroseus fruiting body and mycelium extracts, and from the results obtained, a clear anti-inflammatory and antimicrobial potential of the tested samples can be inferred. Therefore, these formulations can be used to prepare dietary supplements for nutraceutical purposes. This study reveals the potential of the SMS from P. pulmonarius cultivation as a source of biologically pretreated lignocellulosic fibers, useful for the obtainment of cellulosic ethanol. Nowadays, the cost of production of cellulosic ethanol is relatively high. The use of SMS could be a strategy for improving the yield and reducing the costs of the process.

Idioma: Português Data de Publicação: 2016 Local de Publicação: Maringá, PR Orientador: Prof.ª Dr.ª Rosane Marina Peralta Instituição: Universidade Estadual de Maringá . Centro de Ciências Agrárias Nível: Tese (doutorado em Ciência de Alimentos) UEM: Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

Responsavel: edson
Categoria: Aplicação
Formato: Documento PDF
Arquivo: TESE RUBIA IMPRESSÃO.pdf
Tamanho: 1449 Kb (1483993 bytes)
Criado: 06-06-2017 17:31
Atualizado: 06-06-2017 17:43
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