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Consultar: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

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Ttulo [PT]: Contribuies para o conhecimento dos efeitos do BHT e outros antioxidantes no fgado
Autor(es): Lorena dos Santos Castro
Palavras-chave [PT]:

Metabolismo heptico. Ensaios enzimticos. Anlises antioxidantes. Hidroxitolueno butilado. Antioxidantes. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Antioxidants. Butylated hydroxytoluene. Liver metabolism. Brazil.
Titulao: Mestre em Cincia de Alimentos
Banca:
Adelar Bracht [Orientador] - UEM
Ana Carla Broetto Biazon
Cristiane Vizioli de Castro Ghizoni
Resumo:
Resumo: O hidroxitolueno butilado (BHT) amplamente utilizado como antioxidante pela indstria alimentcia, cosmtica, farmacutica e em produtos derivados do petrleo. tambm comercializado em cpsulas como suplemento alimentar para a sade. Como antioxidante, inibe a peroxidao lipdica, efeito que tambm pode exercer em sistemas biolgicos. Sabe-se que a ingesto de substncias capazes de eliminar radicais livres (antioxidantes) pode, pelo menos em parte, evitar os efeitos deletrios das espcies reativas de oxignio (ROS). A gerao dessas espcies nas mitocndrias muito importante, podendo contribuir significativamente para danos em organelas e em vrias patologias. Sendo assim, bons eliminadores de radicais livres devem estar ativos na menor concentrao possvel, permitindo a ingesto de doses mais baixas possveis. A capacidade dos antioxidantes na eliminao dos radicais livres geralmente avaliada utilizando ensaios qumicos, como os mtodos baseados na neutralizao dos radicais gerados pelos compostos 1,1-difenil-2-picril-hidrazila (DPPH) e cido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfnico (ABTS). No existe garantia de que uma determinada substncia ativa na eliminao de radicais livres num sistema artificial tambm seja capaz de eliminar com a mesma eficincia as espcies reativas de oxignio produzidas pelas mitocndrias. Em adio aos seus efeitos como antioxidante, potenciais efeitos adversos associados ao uso do BHT j foram relatados. Por exemplo, existem relatos de que o BHT capaz solubilizar membranas lisossomais e desorganizar a estrutura das mitocndrias, o que pode sugerir que este composto interfere com o metabolismo celular. De fato, estudos demonstram que o BHT interfere com o funcionamento mitocondrial por dois mecanismos distintos: desacoplamento entre o transporte de eltrons e a fosforilao oxidativa e inibio do complexo I da cadeia transportadora de eltrons. Estes dados sugerem, em teoria, que o BHT deve estimular ou inibir a captao de oxignio, estimular as vias catablicas e inibir as vias anablicas. Tais aes alm de outras, tm sido claramente demonstradas com vrios desacopladores e inibidores respiratrios. Com base no exposto, o presente trabalho possui dois objetivos distintos: 1) realizar um estudo sistemtico dos efeitos metablicos do BHT no fgado de rato, utilizando o fgado em perfuso isolada e tambm mitocndrias isoladas e 2) comparar a atividade sequestradora de radicais livres do BHT e de vrios outros antioxidantes bem conhecidos em sistemas qumicos com aquela exercida em mitocndrias isoladas. Em relao a este ltimo aspecto, este estudo dever informar sobre o real potencial antioxidante do BHT e de diversos outros antioxidantes num sistema biolgico (gerao de ROS em mitocndrias). Nos experimentos foram utilizados ratos machos Wistar, pesando 200- 280g. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes ticas aceitas mundialmente para experimentao em animais e foram previamente aprovadas pelo Comit de tica em Experimentao Animal da Universidade de Maring (protocolo n 9120290915). Para os experimentos de perfuso do fgado isolado de rato, foi utilizado um sistema de perfuso no-recirculante, livre de hemoglobina (tampo Krebs/Henseleit- bicarbonato, pH 7,4, saturado com O2:CO2 na proporo 95:5). Ratos em jejum de 18 horas foram utilizados. O BHT foi dissolvido no lquido de perfuso e infundido em concentraes de 1 a 500 μM. Lactato e frutose foram utilizados como substratos neoglicognicos e, a partir das amostras do perfusado, foram feitos ensaios enzimticos para determinao da concentrao de glicose, lactato e piruvato. O consumo de oxignio foi monitorado continuamente por um eletrodo de platina. Dois ensaios distintos foram realizados para avaliar os efeitos do BHT sobre a atividade respiratria de mitocndrias. Os primeiros ensaios foram aqueles clssicos utilizando mitocndrias intactas e fosforilantes, onde a velocidade do consumo de oxignio na ausncia (estado IV) ou presena (estado III) de ADP foi avaliada, assim como o controle respiratrio (RC). Nestes experimentos, succinato foi utilizado como substrato e o BHT foi utilizado numa faixa de concentrao de 10 a 100 μM. Alm destes experimentos, foram realizados ensaios com mitocndrias no-fosforilantes, nos quais a oligomicina (inibidor clssico da ATP sintase) foi utilizada. Succinato foi tambm utilizado como substrato e o BHT testado numa faixa de concentrao entre 2x10-9 a 10-4 M. Alm disso, foi avaliado o efeito do BHT e de outros 13 antioxidantes diferentes sobre a produo de ROS em mitocndrias intactas. A produo de ROS foi estimada atravs da medio do aumento de fluorescncia linear (504 nm para excitao e 529 nm para emisso) devido formao de 2'-7'-diclorofluorescena (DCF) via oxidao por H2O2 na presena de peroxidase de raiz forte, utilizando succinato como substrato. Por fim, a capacidade antioxidante qumica in vitro do BHT e destes 13 antioxidantes foi avaliada utilizando os ensaios do ABTS e do DPPH. No foram encontrados sinais de que o BHT desacopla a fosforilao oxidativa no fgado perfundido de forma significativa, embora estes efeitos paream estar claros em mitocndrias isoladas. Contrariamente ao que se espera de um desacoplador, o BHT no estimulou o consumo de oxignio nem inibiu a neoglicognese a partir do lactato. Isso porque na faixa de concentrao at 200 μM no houve inibio da produo de glicose ou do consumo de oxignio. Apenas nas concentraes de 500 μM pequenos aumentos em ambos os parmetros foram encontrados. A produo de piruvato apresentou uma tendncia a aumento na concentrao de 50 μM, seguido por um pico com 100 μM, com posterior retorno aos nveis basais. Em virtude de relatos que o BHT poderia desacoplar a fosforilao em concentraes muito baixas (10-9 to 10-6 M), tambm foram feitos experimentos na concentrao de 1 μM (10-6 M), porm no foram observadas modificaes no consumo de oxignio, produo de glicose e piruvato. A transformao da frutose em glicose tambm no foi afetada pelo BHT. Apenas na concentrao de 100 μM a produo de lactato a partir de frutose foi aumentada para um grau aprecivel. Porm na passagem de 100 a 200 μM a produo de lactato retornou s taxas basais. Paralelamente ao aumento na produo de lactato, houve um pequeno aumento no consumo de oxignio apenas na concentrao de 200 μM e uma tendncia crescente na produo de piruvato. Estes resultados demonstram, portanto, a ausncia de uma ao inibitria do BHT sobre a sntese de glicose, o que sugere uma interao muito fraca do composto com a cadeia respiratria das mitocndrias dentro das clulas hepticas. O efeito desacoplador do BHT em mitocndrias isoladas foi confirmado, mas apenas em concentraes acima de 10 μM...

Abstract: Butylated hydroxytoluene (BHT) is amply utilized as an antioxidant in industrially processes foods, cosmetics, pharmaceutical and petrochemical products. It is also commercialized in the form of capsules as a food and health supplement. As antioxidant, BHT inhibits lipid peroxidation, an effect that it also exerts in biological systems. There is also a universal consensus that ingestion of molecular species able to scavenge free radicals (antioxidants) can, in part at least, prevent the deleterious effects of the reactive oxygen species (ROS). The mitochondrial ROS production can contribute significantly to damages to the organelles in several pathologies. For this reason, good free radical scavengers should be active at the lowest possible concentration, allowing the ingestion of lowest possible doses. The evaluation of the antioxidant activity of a given substance is usually assessed by chemical methods, such as those ones based on the capacity of scavenging free radicals generated by the compounds 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). There is obviously no guarantee that a given substance active in scavenging free radicals in an artificial system will also be able to scavenge with the same efficiency the reactive oxygen species produced in the mitochondria, for example. In addition to its effects as antioxidant, potential adverse effects of BHT were already reported. For example, there are studies showing that BHT labilizes the lisosomal membranes and disorganizes the mitochondrial structure, facts that could suggest that BHT interferes with cellular metabolism. In fact, there are reports that BHT affects mitochondrial functioning by, at least, two different mechanisms: uncoupling between electron transfer and oxidative phosphorylation and inhibition of complex I of the electron transport chain. This data suggest, in theory, that BHT should either stimulate or inhibit oxygen uptake, stimulate catabolic pathways and inhibit anabolic pathways. Such actions, beside others, have been clearly demonstrated to occur with several uncouplers and respiratory inhibitors. Taking into account what was exposed above, this work has two main objectives: 1) to conduct a systematic study on the effects of BHT on the rat liver, using both the isolated perfused rat liver and isolated mitochondria; 2) to compare the free radical scavenging activity of BHT and other well known antioxidants in chemical systems and in isolated mitochondria. Regarding the latter aspect, this study should clarify about the real antioxidant potential of BHT and several other antioxidants in a biological system (ROS generation in mitochondria). Male Wistar rats weighing 200280 g were used in all experiments. All experiments were done in accordance with the worldwide accepted ethical guidelines for animal experimentation and were previously approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation of the University of Maring (protocol n. 9120290915). Isolated perfused rat liver experiments were done using hemoglobin-free, non-recirculating perfusion (Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer, pH 7.4, saturated with O2:CO2 in the proportion of 95:5). BHT was dissolved into the perfusion fluid and infused in the concentration range of 1-500 μM. Lactate and fructose were used as gluconeogenic substrates. Samples of the perfusion fluid were collected and enzymatically analysed for glucose, lactate and pyruvate. Oxygen uptake was continuously monitored by a platinum electrode. The mitochondrial respiratory activity was evaluated by two different assays. The first one was the classical assay in which intact phosphorylating mitochondria were used. Succinate was used as the substrate and the rate of oxygen uptake in the presence (state III) or in the absence (state IV) of ADP was measured, as well as the respiratory control ratio (RC). The final BHT concentrations in this assay were in the range between 10 and 100 μM. Besides this, assays with non-phosphorylating mitochondria were also performed, with the addition of oligomycin (a classical inhibitor of ATP synthase). Succinate was also used as the substrate and BHT was tested in the range between 2x10-9 to 10-4 M. The effects of BHT and 13 other antioxidants on ROS production in mitochondria were also investigated. The rate of mitochondrial ROS production was estimated by measuring the linear fluorescence increase (504 nm for excitation and 529 nm for emission) due to 2-7-dichlorofluorescein (DCF) formation from the reduced form of 2-7-dichlorofluorescein (DCFH) via oxidation by H2O2 in the presence of horseradish peroxidase, using succinate as substrate. Finally, the in vitro chemical antioxidant capacities were evaluated using both the 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and the 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) assays. We did not found any signs that BHT uncouples oxidative phosphorylation nor that it inhibits the respiratory chain in the perfused liver in a significant way, although these effects seem to be clear in isolated mitochondria. Contrary to what is expected from uncouplers, BHT did not significantly stimulate oxygen uptake nor had an inhibitory action on glucose synthesis from lactate. Actually, there was no inhibition of glucose synthesis or oxygen consumption in the concentration range up to 200 μM. Only at the BHT concentration of 500 μM small increments in both parameters were found. Pyruvate production presented an increasing tendency at 50 μM, followed by a peak increment at 100 μM and a subsequent return to the basal levels. Experiments were also done with very low concentrations of BHT, namely 1 μM (10-6 M), by virtue of the report that BHT might uncouple phosphorylation at very low concentrations (10-9 to 10-6 M). However, no modifications of oxygen uptake, glucose production and pyruvate production were found at low concentrations. Transformation of fructose into glucose was also not affected by BHT. Only lactate production was slightly increased at the concentration of 100 μM...
Data da defesa: 2017
Cdigo: vtls000225992
Informaes adicionais:
Idioma: Portugus
Data de Publicao: 2017
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Adelar Bracht
Co-Orientador: Prof. Dr. Lvia Bracht
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias Agrrias
Nvel: Dissertao (mestrado em Cincia de Alimentos)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: Dissertao com ficha catalografica.pdf
Tamanho: 1183 Kb (1211560 bytes)
Criado: 09-06-2017 16:45
Atualizado: 09-06-2017 16:56
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