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Consultar: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

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Ttulo [PT]: Efeitos inibitrios in vitro da atividade da α-amilase pancretica e salivar e aes hipoglicmicas de taninos condensados e hidrolisveis
Autor(es): Camila Gabriel Kato
Palavras-chave [PT]:

Enzimologia. Amilases. Alfa-amilases. Alfa-amilases pancreticas. Alfa-amilases salivares. Taninos. Inibidores das α-amilases. Cries. Diabetes. Taninos condensados. Taninos hidrolisveis. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
α-amylase inhibitors. Caries. Diabetes. Condensed tannins. Hydrolysed tannins. Brazil.
Titulao: Mestre em Cincia de Alimentos
Banca:
Rosane Marina Peralta [Orientador] - UEM
Flvio Augusto Vicente de Seixas
Joo Carlos Palazzo de Mello
Resumo:
Resumo: Cinco isoamilases tm sido descritas no organismo humano, sendo trs amilases salivares e duas amilases pancreticas. Devido importncia em diversas desordens metablicas incluindo diabetes e obesidade, a amilase pancretica tem recebido mais ateno que a amilase salivar. Em consequncia, uma srie de inibidores da amilase pancretica esto disponveis no mercado, tais como a acarbose, voglibose e miglitol. Entretanto, a amilase salivar humana (HSA), desempenha importantes papis na boca, incluindo hidrlise do amido da dieta, ligao com a superfcie do dente e ligao com bactrias bucais. Todas as trs aes contribuem para o processo de formao da placa dental e formao das cries. Os taninos so molculas exploradas como inibidores das amilases. Acredita-se que a descoberta de novos materiais ricos em taninos capazes de inibir enzimas possam contribuir para a descoberta de novos medicamentos teis no controle e tratamento de diabetes, obesidade e outras desordens fisiolgicas, tais como as doenas da cavidade bucal, incluindo as cries. Um dos mais extensivamente estudados taninos condensados (proantocianidina) o extrado da casca da rvore Acacia negra (Acacia mearnsii De Wild.). Este tanino particularmente rico nos monmeros robinetinidol e fisetinidol. Um dos mais simples e comum tanino hidrolisvel o galotanino com 12 grupos galoil esterificados e um ncleo de glicose. Esta estrutura particularmente abundante no galotanino da galha de Rhus chinensis Mill. (chinese natural gallnut). O objetivo do artigo 1 foi comparar os efeitos inibitrios do tanino condensado de A. mearnsii e do tanino hidrolisvel da galha de R. chinensis sobre as amilase pancretica in vitro e ao hipoglicmica in vivo. Para propsitos comparativos, experimentos similares foram conduzidos utilizando acarbose, eficiente inibidor da amilase pancretica. O objetivo do artigo 2 foi investigar os efeitos inibitrios dos dois taninos descritos acima sobre a amilase salivar. Em ambos os artigos, nos experimentos in vitro foi devotada uma ateno cintica da inibio, com uma detalhada anlise para o modelo que melhor descreve os mecanismos de ao dos inibidores. Amilase salivar humana, amilase pancretica de porco, acarbose e tanino hidrolisvel de galha de Rhus chinensis foram adquiridos do Sigma-Aldrich Co. Tanino condensado de Acacia mearnsii foi adquirido do Labsynth, Brasil. Os experimentos cinticos com as amilases salivar e pancretica foram conduzidos 37 oC em tampo fosfato pH 6.9 contendo 6.7 mM NaCl. Amido de batata (Sigma-Aldrich) foi utilizado como substrato. O substrato e um dos trs inibidores, acarbose, tanino condensado e tanino hidrolisvel foram misturados e a reao foi iniciada pela adio da enzima. A reao ocorreu por 10 minutos. Os acares redutores liberados foram quantificados pelo mtodo do cido 3,5 dinitro-saliclico, utilizando glicose como padro. Anlise estatstica dos dados foi realizada por meio do programa Statistica (Statsoft, Inc., Tulsa, OK). O ajuste das equaes de velocidade inicial aos dados experimentais foi realizada por meio de procedimento iterative no linear de mnimos quadrados utilizando o programa Scientist (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT). A deciso pelo melhor modelo (equao) baseou-se no critrio de seleo de modelo (MSC) e nos desvios-padro dos parmetros otimizados. Ratos machos Wistar com peso entre 200250 g foram utilizados nos experimentos in vivo. Os animais foram divididos em 9 grupos (n = 4 ratos por grupo). No grupo I (controle positivo) amido comercial de milho (1 g por kg de peso corporal) foi administrado intragastricamente. O grupo II (controle negativo) recebeu apenas gua. Grupo III recebeu intragastricamente amido de milho comercial mais acarbose (50 mg/kg). Os Grupos IV, V e VI foi administrado amido de milho comercial e tanino de A. mearnsii nas concentraes 100, 250 e 500 mg/kg respectivamente. Finalmente, nos grupo VII, VIII e IX foi dado intragastricamente amido de milho comercial e tanino hidrolisvel 100, 250 e 500mg/kg respectivamente. A glicemia foi avaliada antes da administrao do amido e inibidores de amilase (tempo 0). Novas avaliaes de glicemia foram realizadas aps 15, 30, 45 e 60 minutos. Um pequeno corte na cauda do animal foi realizado para obteno de sangue para avaliao da glicemia utilizando Accu-Chek Active Glucose Meter. No artigo 1, ambos os taninos inibiram a amilase pancretica. Para uma concentrao de amido (substrato) de 1 g/100 mL, as concentraes de inibidores capazes de inibir a atividade em 50% (EC50) foram de 240 μg/mL tanino hidrolisvel e 200 μg/mL de tanino condensado. Para a acarbose, o EC50 foi 2.2 μg/mL. As cinticas de inibio apresentaram padres complexos nos quais para ambos os inibidores, mais de uma molcula podem se ligar simultaneamente na enzima livre ou na enzima complexada com o substrato (inibio mista parablica). O mesmo fenmeno foi encontrado para a acarbose. Isto revelado a priori pelos plots no lineares 1/v versus [I] e pelos ajustes das equaes cinticas contendo termos de concentrao do inibidor elevado ao quadrado (por exemplo, [I]2). Ambos os taninos foram hbeis em inibir a absoro intestinal de amido, como revelado pelos testes de tolerncia ao amido em ratos. A inibio pelo tanino hidrolisvel foi dependente da concentrao, com 53% de inibio na dose de 100 mg/kg e 88% de inibio na dose de 500 mg/kg. Para o tanino condensado, inibio no foi substancialmente diferente para as doses entre 100 mg/kg (49%) e 500 mg/kg (57%). Podemos concluir que ambos os taninos, mas especialmente o tanino hidrolisvel pode ser til no controle dos nveis glicmicos ps-prandiais em pacientes diabticos. No artigo 2, em experimentos utilizando a amilase salivar humana, foi possvel calcular os valores de EC50 (concentrao do inibidor capaz de produzir uma inibio de 50%) para uma concentrao de amido de 1 g/100 mL de 80 μg/mL e 230 μg/mL para o tanino hidrolisvel e tanino condensado, respectivamente. A partir da anlise dos dados cinticos, pode-se concluir ambos os taninos causam na HAS uma inibio mista (no competitiva). A HAS livre liga-se ao tanino hidrolisvel com maior afinidade, considerando-se o valor de Ki1 de 22.42.9 μg/mL, enquanto Ki1 para o tanino condensado foi de 157.112.6 μg/mL. Levando-se em considerao o importante papel da HAS na formao da placa dentria e subsequente formao da crie dental, a forte ao inibitria do tanino hidrolisvel faz dele um agente til para a manuteno da sade bucal.

Abstract: In the human organism, five isoenzymes of amylase have been described, three salivary amylases and two pancreatic amylases. Due to the importance in several metabolic disorders including diabetes and obesity, the pancreatic-amylase has been more extensively studied than the salivary α-amylase. In consequence, a series of pancreatic α-amylase inhibitors are available in the market, such as acarbose. However, the human salivary amylase (HSA), has important roles in the mouth, including hydrolysis of dietary starch, binding to the tooth surface, and binding to oral streptococci. All three actions contribute to the process of dental plaque and caries formation. Tannins are one of the most extensively studied molecules able to inhibit amylases. It is generally believed that the discovery of new materials rich in tannins with enzyme inhibitory properties can contribute for the discovery of new drugs useful in the control and treatment of diabetes, obesity and other physiological disorders, such as oral diseases, including caries. One of the most extensively studied condensed tannin (proanthocyanidin) is that extracted from the bark of the black wattle tree (Acacia mearnsii De Wild.). It is rich in the catechin-like flavan-3-ols monomers robinetinidol and fisetinidol. One of the most simple and common hydrolysable tannin is the gallotannin with up to 12 esterified galloyl groups and a core glucose. This structure is particularly abundant in the gallotannin from chinese natural gallnuts. The aim of the article 1 was to compare the in vitro inhibitory effects on the pancreatic α-amylase and the in vivo hypoglycemic actions of a condensed tannin from A. mearnsii bark and a hydrolysable tannin from Chinese natural gall (Rhus chinensis Mill.). For comparative purposes, similar experiments were also run with acarbose, a highly effective inhibitor of pancreatic α-amylase inhibitor. The aim of the article 2 was to investigate the in vitro inhibitory effects on the human salivary α-amylase of the same two tannins in the search of new molecules with an increased affinity and specificity for the enzyme. In both articles, in the in vitro experiments, especial attention has been devoted to the kinetics of the inhibition, with a detailed search for the model that best describes the mechanism of action. Human salivary α-amylase (HAS), porcine pancreatic α-amylase, acarbose and hydrolysable tannin from Chinese gall nut were obtained from Sigma-Aldrich Co. The Acacia mearnsii bark tannin was purchased from Labsynth, Brazil. The kinetic experiments with the HAS and pancreatic α-amylase were carried out at 37 oC in 20 mM phosphate buffer pH 6.9 containing 6.7 mM NaCl. Potato starch (Sigma-Aldrich) was used as substrate. Substrate and one of the three inhibitors, acarbose, condensed tannin or hydrolysable tannin were mixed and the reaction was initiated by adding the enzyme. The reaction was allowed to proceed for 5 min. The produced reducing sugars were assayed by the dinitrosalicylic acid method, using maltose as standard. Statistical analysis of the data was done by means of the Statistica program (Statsoft, Inc., Tulsa, OK). Fitting of the rate equations to the experimental initial rates was done by means of an iterative non-linear least-squares procedure using the Scientist software from MicroMath Scientific Software (Salt Lake City, UT). The decision as to the most adequate model (equation) was based on the model selection criterion (MSC) and on the standard deviations of the optimized parameters. Male healthy Wistar rats weighing 200250 g were used in all in vivo experiments. Rats were divided into 9 groups (n = 4 rats per group). To group I (positive control) commercial corn starch (1 g per kg body weight) was administered intragastrically. Group II (negative control) received only tap water. Group III received intragastrically commercial corn starch plus acarbose (50 mg/kg). Groups IV, V and VI received intragastrically commercial corn starch plus A. mearnsii tannin 100, 250 and 500 mg/kg respectively. Finally, groups VII, VIII and IX received intragastrically commercial corn starch plus tannic acid extracts 100, 250 and 500 mg/kg respectively. The amounts of inhibitors given to the rats were based on literature data (Ikarashi et al., 2011). Fasting blood glucose levels were determined before the administration of starch and amylase inhibitors (0 time). Later evaluations of blood glucose levels took place at 15, 30, 45 and 60 min. Blood glucose from cut tail tips was determined using Accu-Chek Active Glucose Meter. In the article 1, both tannins inhibited the enzyme. At a starch (substrate) concentration of 1 g/100 mL the concentrations for 50% inhibition (EC50) were 240 μg hydrolysable tannin per mL and 200 μg condensed tannin per mL. For acarbose the EC50 value was 2.2 μg/mL. The kinetics of the inhibition presented a complex pattern in that for both inhibitors more than one molecule can bind simultaneously to either the free enzyme of the substrate-complexed enzyme (parabolic mixed inhibition). The same phenomenon was found for acarbose. This is revealed a priori by the non-linear 1/v versus [I] plots and by the successful fitting of kinetic equations containing squared inhibitor concentration terms (e.g., [I]2). Both tannins were able to inhibit the intestinal starch absorption, as revealed by starch tolerance tests in rats. Inhibition by the hydrolysable tannin was concentration-dependent, with 53% inhibition at the dose of 100 mg/kg and 88% inhibition at the dose of 500 mg/kg. For the condensed tannin, inhibition was not substantially different for doses between 100 mg/kg (49%) and 500 mg/kg (57%). It can be concluded that both tannins, but especially the hydrolysable one, could be useful in controlling the post-prandial glycemic levels in diabetic patients. In the article 2, in the experiments using HAS, it was possible to calculate the IC50 values (inhibitor concentration producing 50% inhibition) for a starch concentration of 1 g/100 mL of 80 μg/mL and 230 μg/mL for the hydrolysable and condensed tannins, respectively. From the kinetic analysis it can be concluded that inhibition of the HSA by both tannins is of the mixed (or non-competitive) type. The free HSA binds the hydrolysable tannin with higher affinity considering that the Ki1 value was 22.42.9 μg/mL while the Ki1 value for condensed tannin was 157.112.6 μg/mL. Taking into account that HSA has an important role in the dental plaque formation and subsequent dental caries formation, the strong inhibitory action of the hydrolysable tannin could make it an useful agent for oral health.
Data da defesa: 2016
Cdigo: vtls000225996
Informaes adicionais:
Idioma: Ingls
Data de Publicao: 2016
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Rosane Marina Peralta
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias Agrrias
Nvel: Dissertao (mestrado em Cincia de Alimentos)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: DISSERTAO CAMILA COMPLETAarrumada 25-04-16.pdf
Tamanho: 1057 Kb (1081977 bytes)
Criado: 09-06-2017 20:05
Atualizado: 09-06-2017 20:10
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