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Consultar: Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Biologia Celular)

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Ttulo [PT]: Pr-tratamentos de baixo impacto ambiental das fibras lignocelulsicas : contribuies para a obteno do etanol celulsico
Autor(es): Rafael Castoldi
Palavras-chave [PT]:

Fibras lignocelulsicas. Fungos ligninolticos. Pr-tratamento biolgico. Serragem de eucalipto. Pr-tratamento qumico. Nitrognio lquido. Casca de arroz. Sacarificao enzimtica. Crioesmagamento. Brasil.
Palavras-chave [EN]:
Lignocellulosic fibers. Ligninolytic fungi. Biological pretreatment. Liquid nitrogen. Cryo crushing. Enzymatic saccharification. Brazil.
rea de concentrao: Biologia Celular e Molecular
Titulao: Doutor em Cincias Biolgicas
Banca:
Rosane Marina Peralta [Orientador] - UEM
Resumo:
Resumo: A biomassa lignocelulsica composta basicamente por holocelulose (celulose e hemicelulose) e lignina, um polmero extremamente recalcitrante. Os carboidratos presentes na biomassa podem ter diversas aplicaes, incluindo sua utilizao para produo de etanol celulsico, tambm conhecido como bioetanol de segunda gerao. Diversos resduos florestais e agrcolas podem em princpio, serem utilizados como fontes de matria lignocelulsica, que aps hidrlise podem ser fermentados e originar diversos produtos de interesse. Serragem de eucalipto e casca de arroz so dois exemplos deste tipo de material. Para a utilizao dos carboidratos dos residuos lignocelulsicos, necessrio degradar a lignin e diminuir a recalcitrncia da celulose. Estes dois fatores so prioritrios para a utilizao das biomassas com eficincia e baixo custo. Vrios processos so utilizados para remoo da lignina e para diminuir a cristalinidade da celulose. Eles so denominados coletivamente de pr-tratamentos. A maioria dos pr-tratamentos existentes ou apresentam custos elevados ou produzem substncias indesejveis. Novos pr-tratamentos, sejam eles fsicos, qumicos ou biolgicos, devem tentar minimizar estes problemas e buscar a recuperao da maior quantidade possvel dos carboidratos dos materiais lignocelulsicos. Em vista disto, os objetivos deste trabalho foram propor novos pr-tratamentos que permitam uma alta recuperao de carboidratos, reduzam o grau de cristalinidade da celulose, reduzam o teor de lignina e sejam ao mesmo tempo, ambientalmente corretos, i.e., no produzam substncias nocivas. Dois pr-tratamentos foram utilizados: um tratamento biolgico, utilizando fungos da podrido branca da madeira e um pr-tratamento fsico utilizando nitrognio lquido. O pr-tratamento com fungos da podrido branca foi utilizado pois estes fungos possuem um sistema enzimtico capaz de eficientemente degradar a lignina. O prtratamento com nitrognio lquido foi utilizado devido ao fato de que o congelamento ultra rpido pode causar importantes quebras na estrutura da biomassa. A sacarificao enzimtica dos materiais submetidos aos pr-tratamentos foi avaliada para se quantificar a eficincia dos tratamentos. O curso da sacarificao enzimtica foi analisado em termos de uma equao que permite analisar a velocidade inicial de hidrlise e discriminar a frao facilmente hidrolisvel da frao menos facilmente hidrolisvel Adicionalmente, espectrometria infravermelho, microscopia eletrnica e outras tcnicas fsicas foram utilizadas para avaliar as modificaes causadas por cada tratamento. No primeiro artigo da tese, para os pr-tratamentos biolgicos foram utilizados os fungos ligninolticos Ganoderma lucidum, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius e Trametes sp. para tratar a serragem de Eucaliptus grandis. No segundo artigo da tese, utilizou-se o nitrognio lquido (crio esmagamento) para tratar a serragem de E. grandis e a casca de arroz. Para o tratamento biolgico a biomassa lignocelulsica foi seca, triturada e umedecida com soluo mineral e utilizada como substrato para cultivos dos fungos por 30 dias. Aps este perodo, adicionouse gua para extrao do material solvel e as fibras insolveis foram secas at peso constante. Para o pr-tratamento com nitrognio lquido, as fibras in natura foram tratadas com o nitrognio lquido, seguido de um maceramento com pistilo e graal. As fibras pr e ps-tratadas foram submetidas a sacarificao utilizando celulases comerciais de Trichoderma reeseiATCC26921 (Sigma-Aldrich, C 8546), no pr-tratamento biolgico, e celulase e β- glicosidase da Cellic CTec2, e hemicelulases com a Cellic HTec2, (Novozymes, Araucria, PR, Brasil). As misturas foram mantidas em agitador de culturas por 48 h com temperaturas especficas. Aps este tempo, as misturas foram filtradas a vcuo. Os acares redutores presentes nos filtrados foram estimados pelo mtodo do cido 3,5 dinitrosaliclico. Para avaliao da glicose liberada, utilizou-se o mtodo da glicose oxidase-peroxidase. As fibras lignocelulsicas pr e ps-tratamento foram caracterizadas utilizando microscopia eletrnica de varredura e por meio dos espectros na regio espectral do infravermelho por transformada de Fourier para observao das alteraes nas bandas de lignina, celulose e hemicelulose, alm de testes com difrao de raio-X especificamente nos pr-tratamentos com nitrognio lquido. A equao utilizada nos trabalhos foi realizada a partir do procedimento iterativo de mnimos quadrados no-lineares do software MicroMatth Scientific Software (Salt Lake City, UT). No pr-tratamento biolgico na fibra de serragem de E. grandis houve efetividade no tratamento com todos os fungos utilizados. Os melhores resultados foram obtidos com P. ostreatus e P. pulmonarius. Foram encontradas diminuies nas principais bandas de lignina atravs da anlise por FT-IR, 1515 cm-1 (vibraes aromticas em lignina), 1427 cm-1 (grupos siringil e guaiacil condensados). Nas bandas de celulose houve pequena diminuio 1098 cm-1 (celulose cristalina), 1375 cm-1 (celulose e hemicelulose) e 898 cm-1 (celulose amorfa), alm de transformao de celulose cristalina em amorfa, fator importante para sacarificao eficiente. Na microscopia eletrnica houve aparecimento de buracos, indicando uma alterao feita pelos fungos na fibra, aumentando a sua digestibilidade. Os resultados obtidos a partir da anlise da cintica da celulase demonstrou que h uma parte facilmente hidrolisvel de celulose (celulose amorfa) seguida de uma segunda parte de hidrlise mais difcil (celulose cristalina) mais difcil de hidrolisar. Os fungos utilizados, principalmente P. ostreatus e P. pulmonarius so muito eficientes em tornar a celulose da serragem de E. grandis mais facilmente hidrolisvel pela celulase de T. reesei. No pr-tratamento utilizando nitrognio lquido tanto nas fibras de serragem de E . grandis como na casca de arroz, houve uma desestruturao da fibra lignocelulsica visualizadas apenas pelas imagens de microscopia eletrnica. Os resultados obtidos por FTIR, difrao de raios-X e as avaliaes qumicas dos contedos em lignina (mtodo de Klason e mtodo de brometo de acetila) mostraram apenas pequenas variaes no significativas das fibras aps o pr-tratamento. Entretanto, a sacarificao (liberao de acares redutores e glicose) foi acentuadamente aumentada, em torno de 10 vezes quando comparadas sacarificao das fibras no pr-tratadas (54% e 40% de sacarificao da holocelulose da serragem de E. grandis casca de arroz, respectivamente). Os dois pr-tratamentos so ambientalmente corretos, visto no se utilizar compostos qumicos, no ser produzidos resduos txicos e no envolver grandes consumos de gua. O pr-tratamento biolgico com P. ostreatus e P. pulmonarius, proporcionou uma degradao seletiva da lignina e uma transformao da celulose cristalina em amorfa, o que aumentou a acessibilidade das enzimas celulolticas ao substrato. O prtratamento com nitrognio lquido (crio esmagamento) tambm foi muito efetivo no aumento do rendimento da sacarificao, principalmente pela desconstruo da estrutura lignocelulsica. Neste caso no houve degradao da lignina e tampouco houve reduo da cristalinidade da celulose. Entretanto, o rpido congelamento das fibras ocasionou um relaxamento das interaes entre os polmeros das fibras (afrouxamento), o que favoreceu o acesso das enzimas aos substratos. Concluindo, os dois pr-tratamentos foram eficientes e encaixam-se dentro da tendncia mundial de uso de pr-tratamentos de biomassa lignocelulsica menos nocivos ambientalmente.

Abstract: The lignocellulosic biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. The latter has a recalcitrant structure that hampers the obtainment of carbohydrates. Processing of carbohydrates of biomasses may have different purposes, among them, the production of cellulosic ethanol, also known as second generation bioethanol. This ethanol is produced from wasted inexpensive material that results especially from agrobusiness operations. Some of the biomasses used to produce this biofuel are produced in large quantities and have potential for fuel production, as for example, Eucalyptus grandis sawdust and rice husk, biomasses that are seldom used for obtaining carbohydrates. In order to use the carbohydrates of these biomasses it is required to degrade the lignin and decrease the recalcitrance of cellulose. These two factors are priorities to be considered for using these biomasses with efficiency and low costs. Several processes are used for removing lignin and for decreasing the crystallinity of cellulose. They are known collectively as pretreatments. Most of the existing pretreatments are either very expensive or produce unwanted substances. Therefore, a pretreatment that minimizes these disadvantages is required. Additionally, any pretreatment, be it physical, chemical or biological, should allow to recover as much carbohydrates as possible. Taking into account these guidelines, the goal of this thesis was to propose pretreatments that allow a highly efficient carbohydrate recovery by reducing the cellulose degree of crystallinity or even by degrading lignin and that are, at the same time, environmentally friendly, i.e., pretreatments that do not produce large amounts of waste material. For this purpose, two pretreatments are proposed, a biological treatment with basidiomycetes fungi and a physico-chemical treatment with liquid nitrogen cryo crushing). The pretreatment with white rot fungi was used because these organisms possess an enzymatic apparatus capable of degrading lignin efficiently. The liquid nitrogen pretreatment was used due to the ultra-fast freezing that occurs, a phenomenon that may cause important breaks in the biomass structure. The enzymatic saccharification of the treated materials was measured in order to quantify the efficiency of the treatment. The time course of the enzymatic saccarification was analysed in terms of an equation that allows to determine the initial rate of hydrolysis and to discriminate the easily hydrolysable fraction from the fraction that can be less easily hydrolyzed. In addition, infrared spectrometry, scanning microscopy and other physical techniques were used in order to get an insight into the physico-chemical modifications caused by each treatment. For the biological pretreatments of E. grandis sawdust the following ligninolytic fungi were used:Ganoderma lucidum, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius and Trametes sp. Liquid nitrogen (cryo crushing) was used to treat E. grandis sawdust and rice hulls. For the biological treatment, the lignocellulosic biomass was dried, grinded and moistened with a mineral solution and utilized as a substrate for fungi cultures for 30 days. After this time, water was added to extract the soluble material and the insoluble fibers were dried to constant weight. For the pretreatment with liquid nitrogen the fibers in natura were treated with liquid nitrogen, followed by maceration with a pestle and mortar. The pre- and biologically post-treated fibers were subjected to saccharification using commercial cellulases of Trichoderma reesei ATCC 26921 (Sigma- Aldrich C 8546). Cellulase and β-glucosidase Cellic CTec2, and hemicellulases Cellic HTec2 (Novozymes, Araucaria, PR, Brazil) were used in the saccharification of the liquid nitrogen-treated fibers.The mixtures were maintained in shaker cultures for 48 h at specific temperatures. After this time, the mixtures were vacuum filtered. The reducing sugars present in the filtrates were estimated by the 3,5-dinitrosalicylic acid method. Glucose was measured using a glucose oxidase-based assay in the case of the liquid nitrogen pre-treated fibers. The lignocellulosic fibers pre- and post-treatment were characterized using scanning electron microscopy and by Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy for characterizing modifications in the lignin, cellulose and hemicellulose absorption bands. X-ray diffraction was used for testing specifically the modifications caused by the liquid nitrogen pretreatment. Equation fitting to experimental data was done by an iterative nonlinear least-squares procedure using the Scientist software from Micro Matth Scientific Software (Salt Lake City, UT). The biological pretreatment of the E. grandis sawdust fiber was effective with all the fungi that were used. The best results, however, were obtained with P. ostreatus and P. pulmonarius. FTIR analysis showed decreases in the major absorption bands of lignin, namely 1515 cm-1 (aromatic vibrations of lignin) and 1427 cm-1 (condensed guaiacyl and syringyl). In the cellulose bands there were small decreases in 1098 cm-1 (crystalline cellulose), 1375 cm-1 (cellulose and hemicellulose) and 898 cm-1 (amorphous cellulose), besides crystalline cellulose transformation into amorphous cellulose, important factor for an efficient saccharification. Electron microscopy revealed the appearance of holes, indicating a change made by fungi in the fibers, increasing its digestibility. The results obtained from the kinetic analyses of the cellulase action indicated an easily hydrolyzable part of cellulose in addition to a second fraction more resistant to hydrolysis. Pleurotus ostreatus and P. pulmonarius were very effective in making the pulp from sawdust E. grandis more readily hydrolysable by T. reesei cellulase. In the pretreatment using liquid nitrogen both E. grandis sawdust fibers and rice hulls experienced several structural modifications suggesting a disruption or weakening of the interactions between lignin and hemicellulose as well as between lignin and cellulose. X-ray diffraction indicates an increase in cellulose crystallinity, an observation suggesting a detachment between cellulose and lignin. The lignin content, however, measured by the methods of Klason lignin and complete solubilization of lignin with acetyl bromide, was not significantly diminished. This suggests that changes in the cellulose structure and separation of lignin from cellulose may already turn the polysaccharide more easily hydrolysable. Good yields of reducing sugars and glucose were found in the saccharification of the treated fibers, with maximal values of 54% and 40% for the holocellulose of E. grandis sawdust and rice husk, respectively. The yields obtained with the non-treated fibers were approximately 3-5% for both E. grandis sawdust and rice hulls. In the biological pretreatment with E. grandis there was a selective degradation of lignin by the fungi P. ostreatus and P. pulmonarius, as revealed by electron microscopy and FTIR analysis, leading to an increased efficiency of the enzymatic saccharification of cellulose. The kinetics of saccharification of the treated biomasses resembles in many aspects that of pure cellulose. The pretreatment with liquid nitrogen was also very effective in increasing the yield of saccharification, mainly by the deconstruction of the lignocellulosic structure. The two forms of pretreatment are in conformity with a worldwide trend that postulates the use of lignocellulosic biomass pretreatments that are less harmful to the environment and that are at the same time highly efficient in the release of fermentable carbohydrates.
Data da defesa: 2016
Cdigo: vtls000227173
Informaes adicionais:
Idioma: Ingls
Data de Publicao: 2016
Local de Publicao: Maring, PR
Orientador: Prof. Dr. Rosane Marina Peralta
Instituio: Universidade Estadual de Maring . Centro de Cincias Biolgicas
Nvel: Tese (doutorado em Cincias Biolgicas)
UEM: Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas

Responsavel: edson
Categoria: Aplicao
Formato: Documento PDF
Arquivo: Tese completa - Rafael Castoldi.pdf
Tamanho: 3642 Kb (3729615 bytes)
Criado: 21-11-2017 20:50
Atualizado: 21-11-2017 21:06
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